Стереотаксическое введение вирусов для стабильной генетической модификации в мышиной модели

Аннотация

Источник: Porlan, E., et al. Стабильная и эффективная генетическая модификация клеток взрослой мыши V-SVZ для анализа автономных и неавтономных эффектов нейронных стволовых клеток. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется стабильная генетическая модификация нейральных стволовых клеток (НСК) в желудочково-субвентрикулярной зоне (V-SVZ) путем стереотаксической инъекции вирусонесущего терапевтического гена в мышиной модели. Вирус проникает в НСК, подвергается обратной транскрипции, интегрируется в геном и обеспечивает стабильную и эффективную генетическую модификацию для нейротерапевтических применений.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Стереотаксическая инъекция латерального желудочка (ЛЖ) в желудочково-субвентрикулярную зону (V-SVZ)/границу стриатума или в

1. микроинъекцию ЛЖ LV
   1. Выберите и стерилизуйте инструменты, необходимые для операции (скальпель, дрель и маленький пинцет).
   2. Обезболите 6-8-недельную мышь путем внутрибрюшинной инъекции (ip) смеси кетамина и медетомидина под наблюдением ветеринара. Взвесьте каждое животное и дозаведите 50-75 мг кетамина и 0,5-1 мг медетомидина на кг массы тела мыши (около 100-125 мкл рабочего раствора кетамина/медетомидина на мышь).
   3. Оцените уровень анестезии, ущипнув пальцы ног, хвост или ухо и убедившись, что животное не проявляет никакой реакции.
   4. После того, как мышь будет обезболива, введите буторфанол подкожно в окончательной дозе 0,4-0,5 мг на кг веса мыши, чтобы свести к минимуму послеоперационную боль.
   5. Побрейте область между ушами и продезинфицируйте кожу с помощью йодофора, такого как йодоповидон или 70% этанол. Очищайте с помощью стерильных аппликаторов с ватным наконечником. Будьте осторожны, чтобы не намочить животное чрезмерно, так как это может усугубить переохлаждение.
   6. Поместите животное в положение лежа на стереотаксическую раму и аккуратно зафиксируйте голову с помощью ушных планок и небной поддержки аппарата. Держите мышь с грелкой, установленной при температуре 37 °C, и нанесите на глаза офтальмологическую смазку.
   7. Сделайте надрез длиной 1 см на коже головы в продольном направлении с помощью скальпеля и аккуратно втяните кожу, чтобы обнажить череп с помощью тонкого пинцета.
   8. Тщательно очистите поверхность кости стерильным аппликатором с ватным наконечником. Очистите обнаженную кость черепа от остатков тканей.
   9. Установите стерилизованный шприц на стереотаксическое устройство с помощью держателя шприца.
   10. Перемещайте держатель шприца по осям x, y и z до тех пор, пока кончик иглы шприца не окажется на брегме, точке соединения, где сагиттальный (продольный и медиальный) шов перпендикулярно пересекается корональным швом (рис. 1b). Убедитесь, что «нулевое» положение дорсо-вентральной оси (DV) находится на поверхности черепа в точке bregma.
   11. Переместите шприц в координаты назначения x и y (см. таблицу 1 и рисунок 1b).
   12. Аннотируйте координаты назначения x, y и z на шкале Вернье, чтобы иметь возможность вернуться к месту инъекции позже. Отметьте кость в координатах x и y с помощью хирургического маркера.
   13. Отодвиньте шприц от рабочей зоны.
   14. С помощью электродрели сделайте отверстие в черепе аккуратно, чтобы не повредить мозг. Не сверлите поверхность пиала, так как это может повредить поверхность мозга.
   15. Загрузите в шприц 1 μл вирусного раствора 10⁶ TU/μl (трансдукционных единиц на микролитр). Используйте острую иглу 33-го калибра со скосом, кончик которой имеет угол 10-12°. Расположите иглу шприца под углом 90° по отношению к поверхности мозга.
   16. Переместите шприц обратно к месту инъекции и двигайте его вниз до тех пор, пока кончик не коснется поверхности пиала.
   17. Проникните в мозг с помощью шприца до координаты z по оси DV.
   18. Медленно высвобождайте вирусную суспензию со скоростью 0,2 мкл/мин, чтобы свести к минимуму повреждение тканей мозга из-за чрезмерного давления жидкости.
   19. Подождите 5-10 минут, чтобы свести к минимуму обратный поток вирусной суспензии, а затем очень медленно втяните шприц.

Область инъекции	Координаты
	передне-задние (AP)	Медио-латеральные (ML)	Дорсо-вентральные (DV)
Граница СЭЗ/стриатума	0,6 мм	+1,2	мм-3,0 мм
Латеральный желудочек-0,3	мм	+1,0	мм-2,6 мм

+

Таблица 1: Стереотаксические координаты для инъекций. Для передне-задней (AP) и медиолатеральной (ML) осей координаты x и y задаются в виде расстояния (в мм) от брегмы. «-» обозначает «в сторону задней части». Для координат DV «ноль» — это поверхность черепа в точке брегмы, а координаты DV указывают на расстояние (в мм) вниз от этой точки.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение различных частей процедуры. (a) Получение ЛЖ для исследований по мечению in vivo, начиная с трансфекции эмбриональных клеток почки 293T (HEK293T) человека соответствующими плазмидами для получения ЛЖ и заканчивая опред...

Материалы