Манипуляции с клетками нервной пластинки с помощью внутриутробной наноинъекции в эмбриональной модели мыши

Аннотация

Источник: Mangold, K., H el. al., Mouse Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) на эмбриональный день 7.5. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется метод внутриутробной наноинъекции для нацеливания на нейронные пластины в эмбриональной модели мыши. Раствор лентивируса с высоким титром вводится в амниотическую полость, где он интегрируется в клетки нервной пластинки, обеспечивая стабильные манипуляции с генами для исследований в области развития нервной системы и терапевтического применения.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Инъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты, используемые в этой процедуре, стерилизуются перед операцией и между каждой мышью.

1. Обезболивайте первую самку с полостью идеального размера.
2. Поместите и закрепите самку на столе.
3. Нанесите глазной гель на глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы, и введите обезболивающие подкожно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые анальгетики: Бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг массы тела) или Флуниксин (2,5 мг/кг) или аналогичные в соответствии с местными правилами содержания животных. Мультимодальная периоперационная анальгезия поддерживается с помощью инъекционных анальгетиков и изофлурана.
4. Асептически подготовьте нижнюю часть живота, протерев тканью, смоченной в 0,5 мг/мл раствора хлоргексидина (или аналогичного) и высушив кожу. Хирургическими ножницами сделайте вертикальный разрез кожи по средней линии в нижней части живота на 1,5-2,0 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте операционную зону в соответствии с утвержденными на местном уровне процедурами дезинфекции.
5. Аккуратно поднимите кожу и освободите кожу от нижнего мышечного слоя, примерно на 1 см вокруг точки разреза, чтобы облегчить наложение швов после операции.
6. Сделайте вертикальный разрез по средней линии диаметром 1 см в мышечном слое.
7. С помощью пары щипцов поднимите одну сторону кожи и мышечного слоя, а другой парой ищите маточные рога.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Децидуальные кости расположены как бусины на ожерелье, в то время как кишечник представляет собой одну длинную непрерывную трубку (рисунок 1А).
8. С помощью щипцов аккуратно вытащите оба маточных рога из области живота. Удерживайте ткань между эмбрионами; не сдавливайте их напрямую (Рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Матка прикрепляется к телу в месте шейки матки, а два яичника/яйцевода прикрепляются через связки. Не тяните/не отрывайте матку от этих опорных точек.
9. Посчитайте и запишите количество эмбрионов с левой и правой стороны.
10. Пронумеруйте эмбрионы либо от яичника к шейке матки, либо от шейки матки к яичнику.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это особенно важно, если инъецированные эмбрионы будут собраны на эмбриональных стадиях.
11. С помощью влажного ватного тампона аккуратно протолкните все эмбрионы обратно в брюшную полость, кроме первых трех, которые будут введены внутрь.
12. Поместите каплю PBS (фосфатно-солевой буфер) на элатик в чашке Петри и держите ее непосредственно над эмбрионами.
13. Вставьте закрытые щипцы в разрез резинки и отпустите щипцы, чтобы открыть эластичный разрез, чтобы жидкость капнула на эмбрионы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает регидратацию эмбрионов и то, что эластичная мембрана прилипает к влажной коже женщины, предотвращая утечку PBS на следующих этапах.
14. Протяните через резинку щипцами участок матки, соответствующий трем эмбрионам, и аккуратно прижмите чашку Петри к животу самки.
15. С помощью щипцов и влажного ватного тампона отрегулируйте положение матки и резинки, чтобы убедиться, что резинка прилегает к коже женщины и предотвращает утечку PBS.
16. Используйте четыре глиняные ножки, чтобы закрепить и закрепить чашку Петри непосредственно над животом, снижая давление на самку и чувствительность визуализации к дыханию и сердцебиению самки.
17. Нажмите на пластилиновый цилиндр справа от эмбрионов/матки, чтобы зафиксировать матку (Рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инструкция по ориентации предполагает, что игла находится слева от женщины и что эмбрионы левого рога матки женщины обнажены. Сторона матки (левый или правый маточный рог) имеет решающее значение, так как амниотический сосуд (АС) либо обращен к игле (левый рог; Рисунок 1D) или обращен к стабилизирующему глиняному цилиндру (правый рог; Рисунок 1E).
18. Чтобы ввести эмбрионы из правого маточного рога, поместите глиняный цилиндр с левой стороны эмбрионов (Рисунок 1F) и поверните нагревательный стол на 180° (Рисунок 1G) для достижения правильной ориентации. Если вместо этого иглу можно переместить, отрегулируйте ее в соответствии с соответствующей установкой.
19. Добавляйте PBS в чашку Петри до тех пор, пока эмбрионы и матка не покроются PBS.
20. Опустите ультразвуковой зонд в PBS и отрегулируйте мышь/хирургический стол так, чтобы первый эмбрион был выровнен с ультразвуковым зондом, чтобы облегчить запись инъекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: «Первый» относится к нумерации эмбрионов от яичника до шейки матки.
21. Просканируйте все три эмбриона и осмотрите АК. Определите объем инъекции следующим образом:
    1. Измерьте диаметр кондиционера с помощью ультразвукового аппарата. Впрыскивание 69 нл, если диаметр переменного тока составляет ≤0,2 мм; впрыск 2 x 69 нл (= 138 нл), если диаметр переменного тока составляет >0,2 мм и ≤0,29 мм; и ввести 3 x 69 нл (= 207 нл), если диаметр AC > 0,29 мм (рис. 1H).
       >ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие эксперименты показали, что до 207 нл объемов впрыска хорошо переносятся при E7,5. Успешные инъекции с минимальным влиянием на выживаемость достигаются, когда относительное увеличение объема АК не превышает 90%. Различия в размере AC между однопометниками или линиями мышей являются распространенными и могут потребовать дальнейшей оптимизации.
22. Установите объемы впрыска с помощью контроллера впрыска.
23. Установите медленную скорость впрыска со скоростью впрыска 23 нл/с.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Разные модели оборудования могут приводить к разным силам впрыска
.
24. Опустите иглу в PBS с помощью основных колес на рельсовой системе (плоскости x и z, рис. 1I) и нажимайте кнопку Empty на контроллере наноинжектора, пока жидкость не достигнет кончика иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла засорилась, нажатие кнопки Empty может растворить засор и/или вытеснить засор.
25. Извлеките иглу из PBS и нажмите кнопку Inject. Убедитесь, что выброшена капля от приблизительно желаемого объема.
26. Опустите иглу в PBS и совместите ее с ультразвуковым зондом и эмбрионом, перемещая наноинъектор с колесом Y-образной плоскости на микроманипуляторе (Рисунок 1J).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик иглы идеально выровнен, когда он выглядит как яркое пятно на ультразвуковом изображении (Рисунок 1K,L). С помощью микроманипулятора иглу можно перемещать во всех трех плоскостях направления.
27. Отрегулируйте угол иглы с помощью колеса угла инъекции, чтобы обеспечить почти перпендикулярный угол инъекции относительно стенки матки. Введите иглу в АК одним движением с помощью колеса для инъекций на микроманипуляторе (рисунок 1J-M). Следите за яркостью кончика иглы. Если кончик иглы исчезает с ультразвукового изображения, переместите ультразвуковой датчик вперед или назад, чтобы вернуть иглу в фокус.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только игла окажется внутри АС, можно внести незначительные изменения в положение иглы и фокус без вреда для эмбриона (регулировка в пределах ~0,3 мм). Не регулируйте положение иглы больше этого.
28. Нажмите Inject (для 207 нл установите громкость на 69 нл и введите три раза). После инъекции подождите еще 5-10 с, прежде чем втянуть иглу одним легким движением.
29. Переместите стадию к следующему эмбриону и повторите шаги 1.22-1.26 для двух других эмбрионов, если они имеют подходящие размеры АС.
30. Поднимите ультразвуковой зонд и иглу из PBS с помощью микроманипулятора. Поверните иглу в сторону от оператора, чтобы избежать повреждений и травм.
31. С помощью щипцов направьте 1-й и 2-й эмбрионы обратно в брюшную полость самки, аккуратно протолкнув их через резинку. Аккуратно возьмитесь за ткань, прилегающую к 3-му эмбриону, и подтяните матку к верхнему концу эластичного разреза. Аккуратно подтяните 4-6-й эмбрионы щипцами и дайте 3-му эмбриону снова войти в брюшную полость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно сделать без изменения PBS или удаления чашки Петри.
32. Повторяйте по мере необходимости до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы с оптимальными АК или не будет достигнут предельный срок.
33. Аккуратно протолкните эмбрионы/матку обратно в брюшную полость самки.
34. Отсадите PBS и удалите чашку Петри. Если вирус был использован, обращайтесь с ним как с инфекционными отходами.
35. Сшейте мышечный слой Викрилом (USP 6-0, длина иглы 13 мм, 3/8 круга) простыми непрерывными или прерывистыми швами и закройте кожу 1-2 зажимами (см. Таблицу материалов).
36. Выключите изофлурановую помпу.
37. Снимите хирургическую ленту и поместите самку в положение лежа (животом вниз) в чистую клетку на нагревательной пластине при температуре 40 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что самка придет в сознание и станет подвижной в течение 10 минут. Убедитесь, что процедура завершена в течение 30 минут. Генетический фон, возраст и вес женщины могут влиять на чувствительность к анестезии. Наблюдайте за мышами во время операции на предмет признаков медленного дыхания (медленное дыхание означает, что анестезия слишком глубокая) или движения (анестезия слишком легкая). Бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг массы тела) или Флуниксин (2,5 мг/кг) или аналогичные, в соответствии с местными правилами содержания животных, могут быть предоставлены через 8 часов после первой инъекции, если это необходимо.
38. Если необходимо ввести еще одну женщину, подготовьте операционную область, наблюдая за пробуждением первой.
    1. Протрите хирургические инструменты 70% этанолом, чтобы удалить остатки крови или ткани, и стерилизуйте их в предварительно нагретом стерилизаторе для стеклянных шариков в течение 10 с. Выбросьте ватные палочки и используйте папиросную бумагу. Вытрите чашку Петри и кусочки глины насухо папиросной бумагой.
39. Повторяйте шаги 1.1-1.35 до тех пор, пока не будут введены все самки.
40. Опорожните и выбросьте иглу.
    1. Если в игле остался вирус или раствор для инъекции, нажмите Empty на наноинъекторе и высыпьте содержимое иглы на папиросную бумагу.
    2. Полностью втяните металлический поршень, нажав Fill до тех пор, пока не раздастся двойной звуковой сигнал контроллера, указывающий на то, что поршень полностью втянут.
    3. Ослабьте цангу и сдвиньте иглу с металлического поршня. Выбросьте иглу в контейнер для отходов острых предметов.
41. Очистите стол BSL-2 (уровень биобезопасности 2).
    1. Если был использован вирус, опрыскайте все хирургическое поле дезинфицирующим средством (см. Таблицу материалов). Через 15 минут сотрите дезинфицирующее средство и очистите все операционное поле 70% этанолом. Если вирус не использовался, очистите все поверхности 70% этанолом.
    2. Сотрите остатки PBS с ультразвукового датчика сухой мягкой папиросной бумагой без ворса.
42. Выбрасывайте отходы в соответствии с рекомендациями по биобезопасности.
43. Выключите ультразвуковой аппарат, нагревательный стол, скамейку BSL2 и питание O₂.

Результаты

Рисунок 1: Оптимальный размер и ориентация амниотической полости для успешных инъекций. (A) Маточный рог с множественными децидуациями Е7.5, по форме напоминающий цепочку сфер (внизу) по сравнению с толстой кишкой (вверху). (<...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл Шприц	BD Bioscience	309628
27 г Игла	BD Bioscience	300635
капилляры 3,5 дюйма	Drummond Scientific	3000203G/X	Использовались для втягивания домашних игл
Преобразователь серии MS 70 МГц	Visual Sonics	MS700
Aquasonic прозрачный гель для ультразвука	Parker	Laboratories Mar-50
Autoclip Applier 9 мм	Angthos	12020-09
CD1 мыши	Charles River, Германия	Crl:CD1(ICR)	Самки: с 8 недельМужчины: с 12 недель
Ватный тампон	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Щипцы перевязочные нежные прямые 13 см	Agnthos	08-032-130
EZ зажимы 9 мм	Angthos	59027	Зажимы
Iris Ножницы, Super Cut, прямые, 9 см	Agnthos	307-336-090
Изофлюоран	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	Приобретено в шведской аптеке
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Мембранная лента	Visual Sonics	SA-11053
Съемник микропипеток	Sutter Instrument	P-97
Пластилин Clay	Sense AB	10209
Стол для работы с мышью	Visual Sonics	50249
Набор автоматических инъекторов Nanoject II	Drummond	3-000-205A
Парапленка	Bemis	HS234526C
чашка Петри с центральным отверстием (низкая стенка)	Visual Sonics	SA-11620
чашка Петри, (ØxH): 92 x 16 мм	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	130000132037	дезинфицирующее средство
Силиконовая мембрана	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, стерилизатор горячих шариков	Angthos	31100
Хирургическая лента (1,25 см x 9,14 м)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System	Visual	Sonics VS-12055
Vevo Станция формирования изображений 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; Игла C-3, фиолетовая нить 45 см	Agnthos	J384H