Перенос генов в шванновские клетки седалищного нерва грызунов с помощью электропорации

Аннотация

Источник: Ino, D. et al., Перенос гена in vivo в шванновские клетки в седалищном нерве грызунов с помощью электропорации. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется перенос генов in vivo в шванновские клетки седалищного нерва грызунов с помощью электропорации. Раствор плазмиды ДНК-красителя вводится в нерв, и электрические импульсы облегчают проникновение ДНК. ДНК позже интегрируется в геном клетки, обеспечивая успешный перенос генов в шванновских клетках.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарной экспертной комиссией JoVE.

1. Получение плазмидной ДНК

1. Создание плазмид ДНК для электропорации in vivo путем субклонирования комплементарной ДНК (кДНК) или короткой РНК шпильки (шРНК) в экспрессирующую плазмиду для клеток млекопитающих. Используйте цитомегаловирус для немедленного раннего энхансера и куриную плазмиду, управляемую слиянием β-актинового промотора (CAG), поскольку она обеспечивает сильную и стабильную экспрессию. Для экспрессии шРНК под контролем промотора CAG используют кассетную систему шРНК на основе mir30 для субклонирования шРНК.
2. Очистите плазмидную ДНК с помощью набора maxi-prep в соответствии с инструкциями производителя и ресуспендируйте ДНК с помощью HEPES-буферизованного физиологического раствора (140 мМ натрия хлорида, NaCl, 0,75 мМ ди-натрия гидрофосфата, Na₂HPO₄, 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинитансульфоновой кислоты (HEPES); pH 7,40). Отрегулируйте концентрацию ДНК до ≥4 мкг/мкл.
3. Приготовьте раствор плазмидной ДНК до концентрации 4 г/л и добавьте минимальное количество быстрого зеленого красителя (конечная концентрация 0,01%) для маркировки места инъекции. Если требуется одновременная электропорация нескольких плазмид, отрегулируйте общую концентрацию раствора плазмидной ДНК до 4 мкг/л.<бр/>ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный состав плазмидных ДНК следует определять в соответствии с эффективностью трансфекции каждой плазмиды.

2. Стерилизация хирургических инструментов и хирургических инструментов в автоклаве с солевым раствором

1. и 0,9% раствором NaCl.

3. Приготовление стеклянной микропипетки

1. Стеклянные пипетки с помощью съемника пипетки. Обрежьте кончик пипетки до диаметра 30-50 мкм. Используйте следующие параметры: Heat, 600; Скорость, 50; Время, 75.

4. Хирургия на животных, инъекция ДНК и электропорация

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор этого этапа описан на рисунке 1. Хотя процедура для крысят описана здесь, метод применим и к более зрелым животным, использующим ту же процедуру.

1. Обезболивайте крысу изофлураном в индукционном боксе до тех пор, пока животное не станет неподвижным, регулируя поток кислорода до 0,4 л/мин и концентрацию изофлурана до 4% (об/об.). Выполните защипывание пальцев ног, чтобы подтвердить правильную анестезию.
2. Поместите крысу на предварительно разогретую грелку под бинокулярным микроскопом и поддерживайте анестезию, непрерывно вводя изофлуран через маску для лица. Отрегулируйте расход кислорода до 0,2 л/мин и концентрацию изофлурана до 2% (об/об.). Используйте глазные капли, чтобы предотвратить сухость глаз, если глаза животного открыты.
3. Зафиксируйте ноги хирургическим пластырем.
4. Очистите кожу на задней части бедра с помощью повидон-йода и сделайте надрез скальпелем
   ПРИМЕЧАНИЕ: Побрейте хирургические участки, если они покрыты волосами.
5. Обнажите седалищный нерв, создав отверстие между четырехглавой мышцей бедра и двуглавой мышцей бедра с помощью швейных игл.
6. Смочите нерв 0,9% раствором NaCl. Впитайте лишнюю воду с помощью безворсовой бумаги.
7. Вставьте основание стеклянной микропипетки в гибкую трубку и налейте достаточное количество раствора ДНК (не менее одного микролитра) в микропипетку путем легкой аспирации.
8. Поднимите обнаженный нерв, осторожно потянув за дистальную сторону нерва с помощью иглы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не натягивайте нерв, чтобы свести к минимуму механическое напряжение.
9. Вставьте стеклянную микропипетку в дистальный участок нерва и введите раствор ДНК под давлением (т.е. дуя в открытый конец гибкой трубки). Вводите раствор ДНК до тех пор, пока нерв не станет зеленым (максимум 1 мкл). Поскольку частое введение микропипетки может повредить нерв, не вводите микропипетку более двух раз.
10. Поместите платиновый электрод пинцетального типа на расстоянии около 1-2 мм от нерва. Заполните зазор между электродом и нервом 0,9% раствором NaCl.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите нерв электродом, чтобы избежать механического напряжения на нерв.
11. Подайте электрические импульсы на место инъекции с помощью электропоратора с электродом. После первого набора импульсов инвертируйте электрод и подайте еще один набор импульсов. Используйте следующие параметры: напряжение, 50 В; длительность импульса, 5 мс; интервал импульсов, 100 мс; количество импульсов, 4 раза.
12. Очистите место электропорации 0,9% раствором NaCl.

5. После электропорации

1. Закройте разрезы цианоакрилатным клеем.
2. После высыхания клея прочистите рану повидон-йодом.
3. Освободите щенка от лицевой маски. Согрейте щенка на грелке не менее часа, чтобы дать ему полностью восстановиться после анестезии.

Результаты

Рисунок 1: Схема метода электропорации in vivo. Сначала обнажается седалищный нерв крысы, находящейся под наркозом. Во-вторых, плазмидная ДНК вводится в седалищный нерв. В-третьих, электрические импульсы подаются к месту инъекции через электрод в форме щи...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор Genopure Plasmid Maxi kit	Roche	03 143 422 001	Набор для очистки плазмиды
ДНК Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Краситель для инъекций ДНК
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Стекло капиллярная
аспирационная трубка	Drummond	05-2000-00	Аспирационная трубка для микроинъекции
МОДЕЛЬ P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.		микропипеток
CUY21 Электропоратор одиночных клеток		BEX CUY21 Генератор	импульсов
Электрический обогреватель	KODEN	CAH-6A	Грелка во время операции
Изофлуолан	Mylan	1119701G1076	Анестетик

Съемник для одиночных клеток