Устойчивая доставка фактора роста нервов с помощью пористой кремниевой пленки в клетках феохромоцитомы 12 крысы

Аннотация

Источник: Rosenberg, M., et al. Конструирование пористых силиконовых пленок в качестве носителей фактора роста нервов. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется использование разлагаемой наноструктурированной пленки из пористого кремния (PSi) для устойчивого высвобождения фактора роста нервов (NGF) для поддержки дифференцировки клеток PC12. NGF адсорбируется в порах пленки в результате электростатических взаимодействий и постепенно высвобождается в среду за счет диффузии и деградации каркаса. Эта контролируемая доставка способствует выживанию клеток PC12 и способствует росту и ветвлению нейритов в течение длительного периода времени.

Протокол

1. Изготовление носителей из оксидированного пористого кремния (PSiO₂)

1. Разрежьте кремниевую пластину (Si) (с одной стороны, полированную на лицевой стороне <100> и сильно легированную бором, p-типа, 0,95 мОм·см) на образцы размером от 1,5 см × 1,5 см с помощью алмазной ручки.
2. Окислить образцы кремния в трубчатой печи при температуре 400 °C в течение 2 ч на окружающем воздухе (скорость нагрева: 25 °C/мин, естественное охлаждение).
3. Погрузите образцы кремния в раствор водной плавиковой кислоты (HF) (48%), воды двойной дистилляции (ddH₂O) и этанола (99,9%) (1:1:3 v/v/v) на 5 минут; затем трижды промойте образцы этанолом и высушите под струей азота.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте и храните раствор HF только в пластиковой посуде, так как HF растворяет стекло.
   ВНИМАНИЕ!: HF является высококоррозионной жидкостью, и с ней следует обращаться с особой осторожностью. В случае воздействия тщательно промыть водой и обработать пораженный участок гелем с антидотом ВЧ; Немедленно обратитесь за медицинской помощью.
4. Установите образец Si в ячейку для травления политетрафторэтилена, используя полоску алюминиевой фольги в качестве обратного контакта и платиновую катушку в качестве противоэлектрода.
5. Протравить жертвенный слой в растворе водного ВЧ и этанола (99,9%) в соотношении 3:1 (v/v) в течение 30 с при постоянной плотности тока 250 мА/^см2; затем трижды промыть поверхность полученной пленки PSi этанолом и высушить под струей азота.
6. Свежепротравленный пористый слой растворить в водном растворе гидроксида натрия (NaOH) (0,1 М) на 2 мин. Затем трижды промыть этанолом и просушить под струей азота.
7. Погрузите образец в раствор водного HF (48%), ddH₂O и этанола (99,9%) (1:1:3 v/v) на 2 мин. Затем трижды промыть этанолом и просушить под струей азота.
8. Электрохимическим протравливанием образца Si в 3:1 (v/v) растворе водного HF и этанола (99,9%) в течение 20 с при постоянной плотности тока 250 мА/^см2; затем трижды промыть поверхность полученной пленки PSi этанолом и высушить под струей азота.
9. Термически окислите свежевытравленные образцы PSi в трубчатой печи при температуре 800 °C в течение 1 ч на окружающем воздухе (скорость нагрева: 25 °C/мин, естественное охлаждение) с образованием пористого каркаса SiO₂ (PSiO₂).
10. Покройте образцы PSiO₂ положительным толстым фоторезистом при 4000 об/мин в течение 1 минуты, затем запекайте образцы с покрытием при температуре 90 °C в течение 2 минут (скорость нагрева: 5 °C/мин, естественное охлаждение).
11. Нарежьте образцы PSiO₂ на образцы размером 8 мм × 8 мм с помощью пилы для нарезки кубиками.
12. Чтобы удалить фоторезист, замочите нарезанные кубиками образцы в ацетоне на 3 ч, затем тщательно промойте этанолом и высушите под струей азота.

2. Загрузка PSiO₂ фактором роста нервов (NGF)

1. Для приготовления раствора для загрузки NGF растворите 20 г мышиного β-NGF в 400 мкл 1:1 (v/v) растворе 0,01 М фосфатно-солевого буфера (PBS) и ddH₂O.
2. Добавьте 52 мкл раствора для загрузки поверх образца PSiO₂ и инкубируйте в течение 2 часов при комнатной температуре (RT) в закрытой чашке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте высокую влажность в чашке, чтобы предотвратить высыхание раствора во время инкубации.
3. Соберите раствор поверх образца для последующей количественной оценки содержания NGF в носителе PSiO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка NGF в PSiO₂ должна быть выполнена непосредственно перед предполагаемым использованием; протокол здесь не может быть приостановлен из-за риска высыхания и денатурации белка.

3. Жизнеспособность и рост клеток в присутствии носителей PSiO₂, загруженных NGF, Культура

1. клеток феохромоцитомы крысы (PC12)
   1. Приготовьте основную среду для роста, добавив 10% лошадиной сыворотки (HS), 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,2% амфотерицина в среду Медицинского института Розелл Парк (RPMI).
   2. Приготовьте среду для дифференцировки, добавив в среду RPMI 1% HS, 1% L-глутамина, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,2% амфотерицина.
   3. Клеточную суспензию (^10-6 клеток) выращивают в колбе с культурой^{75 см 2} с 10 мл основной питательной среды в течение 8 дней; каждые 2 дня добавляйте в колбу по 10 мл основной питательной среды.
   4. Чтобы получить дифференцированную культуру клеток PC12, перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку; центрифугируйте клетки в течение 8 мин при 200 x g и RT. Выбросьте надосадочную жидкость.
   5. Суспензируйте клетки в 5 мл свежей основной питательной среды и повторно центрифугируйте клетки в течение 5 мин при 200 x g и RT; выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 3 мл основной питательной среды.
   6. Чтобы разделить клеточные кластеры, аспирируйте клетки десять раз с помощью шприца 23 G.
   7. Подсчитайте клетки с помощью счетчика гемоцитометров и засемените 10 4 клеток/^см2 рабочую зону на коллагеновых пластинах, покрытых I-образным покрытием, в присутствии дифференцировочной среды.
   8. Через 24 ч добавьте свежий мышиный β-NGF (50 нг/мл) или наполненный NGF носитель PSiO₂ на тарелку.
      >ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие концентрации NGF (>50 нг/мл) обладают точно таким же эффектом, как указанная концентрация.
   9. Обновляйте среду для дифференцировки каждые 2 дня.
   10. Чтобы оценить жизнеспособность клеток, добавьте 10% (v/v) раствора индикатора жизнеспособности (на основе резазурина) в репрезентативные моменты времени и инкубируйте в течение 5 ч при 37 °C; измерьте поглощение при 490 нм с помощью спектрофотометра.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ацетон	Гадот	830101375
амфотерицин	Biological Industries	03-028-1B
Aqueous HF (48%)	Merck	101513
фоторезист AZ4533	Метал Хим, Инк.	AZ4533
BSA фракция v	MP биомедицинские 216006950
раствор BSA (10%)	Biological Industries	03-010-1B
Коллаген типа l	Corning Inc.
Коллагеназа	Enco	LS004176
Пластиковые покровные стекла с коллагеновым покрытием	NUNC Thermanox	1059846
D-(+)-глюкоза	Sigma-Aldrich Chemicals	G8170
Dispase-II	Sigma-Aldrich Chemicals	4942078001
абсолют этанола (99,9%)	Merck	818760
FBS	Biological Industries	04-121-1A
Guanidine-HCl	Sigma-Aldrich Chemicals	G7294
Смесь питательных веществ Ham's F-12	Thermo Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1M)	Thermo Scientific	15630-056
HS	Biological Industries	04-124-1A
L-15 medium	Sigma-Aldrich Chemicals	L5520
Laminin	Thermo Scientific	23017015
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1A
Murine β-NGF	Peprotech	450-34-20
Обычный осел сыворотка (NDS)	Sigma-Aldrich Chemicals	G9023
Papain	Sigma-Aldrich Chemicals	p-4762
PBS (pH 7,4)			Получено путем растворения 10 мМ Na₂HPO₄, 1,8 мМ KH₂PO₄, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl в воде двойной дистилляции (ddH₂O, 18 МОм·см).
PBS X10	Biological Industries	02-020-1A
PC12 клеточная линия	ATCC	CRL-1721
Пенициллин–стрептомицин	Biological Industries	03-032-1B
Poly-L-лизин	Sigma-Aldrich Chemicals	P4832
PrestoBlue реактив	Thermo Scientific	A13261
RPMI medium	Biological Industries	01-100-1A
Si wafer	Siltronix Corp.		Высоколегированный B, p-тип, удельное сопротивление 0,00095 Ω см, <100> ориентированный
азид натрия	Sigma-Aldrich Chemicals	S2002
Гидроксид натрия (NaOH)	Sigma-Aldrich Chemicals	S8045
Дубильная кислота	Sigma-Aldrich Chemicals	403040
Triton X-100	Chem-Impex International Inc.	1279

354236

г.