Экспрессия генов с помощью электропорации одиночных клеток в культурах среза гиппокампа мышей

Аннотация

Источник: Keener, D. G., et al. Электропорация одиночных клеток на различные органотипические культуры срезов возбуждающих и классово-специфических тормозных нейронов гиппокампа мышей. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется процесс электропорации одиночных клеток для введения плазмидной ДНК в нейроны культур среза гиппокампа мыши. Процедура включает в себя точное позиционирование пипетки, регулировку давления и импульсы электропорации для временного проникновения в мембрану нейрона, способствуя переносу генов. После электропорации срез инкубируют, чтобы обеспечить экспрессию введенного гена, представляющего интерес.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка культуры среза

1. Приготовьте органотипические культуры среза гиппокампа мышей, как описано ранее, используя постнатальных мышей от 6 до 7 дней обоего пола.
   1. Приготовьте диссекционную среду для органотипической культуры срезов, состоящую (в мМ): 238 сахарозы, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1₂PO₄ и 11 глюкозы в деионизированной воде, затем газообразный с 5% CO₂/95% O₂ до pH 7,4.
   2. Готовят органотипические среды для срезов, состоящие из: 78,8% (v/v) минимально незаменимой среды Eagle, 20% (v/v) лошадиной сыворотки, 17,9 мМ NaHCO₃, 26,6 мМ глюкозы, 2 М CaCl₂, 2 М MgSO₄, 30 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазина-1-этанессульфоновой кислоты (HEPES), инсулина (1 мкг/мл) и 0,06 мМ аскорбиновой кислоты, рН скорректирован до 7,3. Отрегулируйте осмолярность до 310-330 осмоль с помощью осмометра.
   3. Отделите гиппокамп от всего мозга с помощью двух шпателей и разрежьте (400 мкм) с помощью тканевого измельчителя. Разделите срезы с помощью двух щипцов и перенесите вкладыши для клеточных культур диаметром 30 мм в 6-луночный планшет, заполненный питательной средой (950 мкл) под вкладышами.
2. Храните органотипические культуры срезов в инкубаторе для тканевых культур (35°C, 5% CO₂) и меняйте среду для срезов каждые два дня.

2. Подготовка плазмиды

1. Подготовьте плазмиду для интересующего гена.
   1. Субклонируйте ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в вектор pCAG.
   2. Очистите плазмиду pCAG-EGFP с помощью набора для очистки, не содержащего эндотоксинов, и растворите во внутреннем растворе, состоящем из обработанной диэтилпирокарбонатом воды, содержащей 140 мМ K-метансульфоната, 0,2 мМ этиленгликоля тетрауксусной кислоты (EGTA), 2 мМ MgCl₂ и 10 мМ HEPES, отрегулированного до pH 7,3 с помощью KOH (концентрация плазмиды: 0,1 мкг/мкл).

3. Приготовление стеклянной пипетки

1. Натяните пипетки из боросиликатного стекла (4,5 – 8 МОм) на съемник микропипеток (рис. 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные пипетки, используемые для записи патч-клещей цельных клеток, идеально подходят для электропорации.
2. Выпекайте стеклянные пипетки в течение ночи при температуре 200°C для стерилизации.
3. Проверьте размер наконечника пипетки под микроскопом для препарирования, чтобы приблизительно определить электрическое сопротивление.
   1. Необязательно:Проверьте сопротивление пипетки, присоединив пипетку к электроду электропорации, и используйте микроманипулятор для маневрирования наконечником пипетки в стерилизованную фильтром искусственную спинномозговую жидкость (aCSF), содержащую (в мМ): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1₂PO₄ и 11 глюкозы в деионизированной воде, газообразной с 5% CO₂/95% O₂ до pH 7,4. Проверьте фактическое сопротивление с помощью индикации на электропораторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем острее наконечник пипетки, тем больше электрическое сопротивление. Сопротивление пипетки должно быть ниже 10 МОм. Стеклянные пипетки с высоким сопротивлением пипеток (рис. 1B) часто засоряются на кончике во время многократной электропорации.

4. Настройка установки для электропорации

1. Установите электропоратор в стандартную электрофизиологическую установку с целыми ячейками, оснащенную вертикальным микроскопом, установленным на подвижном столе, микроманипулятором и перистальтическим насосом.
2. Установите головной каскад электропоратора на микроманипулятор и подключите к электропоратору пару динамиков. Подключите электропоратор к ножной педали, которую можно использовать для отправки импульса, когда все будет готово.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Динамики издают звуковой сигнал при включении, который является индикатором электрического сопротивления на электроде. Это дает возможность определить относительные изменения сопротивления, не отвлекая внимание от процедуры.

5. Подготовка к электропорации

1. Перенесите вкладыши для культуры срезов из 6-луночных планшетов в чашки Петри диаметром 3 см, загруженные 900 μл питательной среды и хранящиеся в настольном CO₂-инкубаторе до готовности к проведению электропорации.
   1. Предварительно инкубируйте вкладыши для свежих культур со средой для срезов (1 мл) в течение не менее 30 минут в чашке Петри диаметром 3,5 см для культивирования срезов после электропорации.
2. Очистите и подготовьте установку к электропорации.
   1. Профузируйте линии 10% отбеливателем в течение 5 минут, чтобы простерилизовать трубку и камеру перед началом эксперимента в течение дня.
   2. Пропитайте линии деионизированной автоклавной водой не менее чем на 30 минут для полной промывки.
   3. Перфузируйте линии стерилизованными фильтром aCSF, содержащими 0,001 мМ тетродотоксина (TTX).
      ПРИМЕЧАНИЕ: TTX минимизирует клеточную токсичность и смерть из-за чрезмерного возбуждения интернейронов.
3. Задайте параметры импульса электропоратора: амплитуду 5 В, квадратный импульс, последовательность 500 мс, частоту 50 Гц, длительность импульса 500 μс.
4. Наполните стеклянную пипетку 5 мкл плазмидного внутреннего раствора.
   1. Удалите все захваченные пузырьки воздуха с наконечника пипетки, проведя и осторожно постучав по наконечнику несколько раз.
   2. Проверьте наконечник на наличие повреждений, визуализировав его под микроскопом для вскрытия или повторив шаг 3.3.1 для проверки сопротивления пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если наконечник поврежден, стеклянную пипетку необходимо выбросить, и этот шаг необходимо повторить с новой стеклянной пипеткой, предварительно подготовленной на шаге 3.
5. Надежно прикрепите наконечник пипетки к электроду и включите динамики. Запишите показания (сопротивление пипетки) электропоратора, когда наконечник соприкоснулся со средой aCSF.
6. Разрежьте вставку культуры с помощью острого лезвия и выделите один срез культуры. Осторожно перенесите культуру среза в камеру электропорации с помощью остроугольных щипцов и зафиксируйте ее положение с помощью срезного анкера.
   1. Не храните культуру среза за пределами инкубатора более 30 минут за раз, чтобы предотвратить побочные эффекты, такие как изменения в здоровье или функции нейронов.

6. Электропорировать интересующие элементы

1. Надавите положительным давлением на пипетку ртом или с помощью шприца объемом 1 мл (давление 0,2 - 0,5 мл), прикрепленного к трубке.
2. Используйте 3-мерную ручку управления микроманипулятора для маневрирования наконечником пипетки вблизи поверхности культуры среза.
3. Выберите клетку-мишень и приближайтесь к ней, сохраняя приложенное положительное давление до тех пор, пока на поверхности клетки не образуется ямочка, видимая под микроскопом.
4. Выполняйте циклы давления.
   1. Быстро надавливайте ртом, чтобы между наконечником пипетки и плазматической мембраной образовалось слабое уплотнение, визуально обозначенное мембраной, немного поднимающейся вверх к наконечнику пипетки. Наблюдайте увеличение сопротивления пипетки (~ в 2,5 раза от начального сопротивления), прислушиваясь к увеличению тона, исходящего из динамиков. Быстро снова надавите, чтобы ямочка снова образовалась.
   2. Немедленно завершите еще как минимум два цикла давления без паузы, затем удерживайте отрицательное давление в течение 1 с.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Паузы между циклами, слишком большое давление или слишком долгое удержание отрицательного давления могут привести к значительному повреждению клетки и, возможно, к гибели клетки во время электропорации.
5. Быстро импульсируйте электропоратор один раз с помощью ножной педали, когда тон из динамиков достигнет стабильной вершины высоты, указывающей на пиковое электрическое сопротивление. Не ждите пикового сопротивления более 1 секунды перед отправкой импульса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не наблюдали нецелевой электропорации при использовании этого протокола. Трансфицировали только клетки, контактировавшие со стеклянной пипеткой во время циклов давления. Расположение пипетки рядом с другими нейронами не приводит к трансфекции генов.
6. Осторожно втяните пипетку примерно на 100 мкм от ячейки, не оказывая давления.
7. Снова приложите положительное давление, убедившись, что сопротивление аналогично зарегистрированному показателю на шаге 5.5, затем подойдите к следующей ячейке.
   >
   1. Удалите потенциальные засоры, обозначенные визуально или значительно увеличенным (на >15% выше) сопротивлением пипетки после электропорации, применяя положительное давление.
      >ПРИМЕЧАНИЕ: Если видимого засора нет, а сопротивление все еще значительно выше, выбросьте пипетку и используйте новую. В среднем, пипетку можно использовать для проведения до 20 сеансов электропорации, если пользователь будет осторожен.
8. После электропорации переложите культуру среза на вкладыш для свежей культуры и инкубируйте при температуре 35°C в инкубаторе до 3 дней.

Результаты

Рисунок 1: Два репрезентативных изображения стеклянной пипетки. (A) Отображайте пипетки с более низким сопротивлением (6,5 МОм), используемые в данном протоколе, и (B) пипетки с более высоким сопротивлением (1...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
очистки плазмид	Qiagen	12362
Подготовка органотипических культур для срезов
	Связующее	BD C150-UL
Измельчитель тканей McIlwain	TED PELLA, INC.	10180	Измельчитель тканей для приготовления органотипической культуры срезов
Вставка для клеточных культур Millicell, 30 мм	Вставки		многослойных PIHP03050 Вкладыши для органотипических культур срезов
Осмометр	Прецизионные системы	OSMETTE II
PTFE покрытые шпатели	Cole-Parmer	SK-06369-11
Ножницы	FST	14958-09
Стереомикроскоп	Olympus	SZ61
Стерильная система вакуумной фильтрации	Millipore	SCGPT01RE	Фильтрация и хранение aCSF
Электродный препарат
Капиллярные стекла	Warner Instruments	640796
Микропипеттер Съемник	Инструмент Саттера	P-1000	Съемник
Связующее	средство для духовки	BD (E2)
Съемник Инструмент	Саттера	FB330B	Съемник
Одноэлементная электропорация
3,5 мм Falcon Petri Посуда	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
Система электропорации	Молекулярные устройства	Аксопоратор 800А	Электропоратор

Набор для 6 лунок GREINER BIO-ONE 657160 Dumont #5/45 Щипцы FST#5/45 Угловые щипцы для препарирования органотипических культур срезов Фильтрующая установка колбы Миллипоры SCHVU02RE Фильтрация и хранение питательных сред Инкубатор для