Экспрессия генов с помощью электропорации одиночных клеток в культурах среза гиппокампа мышей

Аннотация

Источник: Keener, D. G., et al. Электропорация одиночных клеток на различные органотипические культуры срезов возбуждающих и классово-специфических тормозных нейронов гиппокампа мышей. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется процесс электропорации одиночных клеток для введения плазмидной ДНК в нейроны культур среза гиппокампа мыши. Процедура включает в себя точное позиционирование пипетки, регулировку давления и импульсы электропорации для временного проникновения в мембрану нейрона, способствуя переносу генов. После электропорации срез инкубируют, чтобы обеспечить экспрессию введенного гена, представляющего интерес.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка культуры среза

1. Приготовьте органотипические культуры среза гиппокампа мышей, как описано ранее, используя постнатальных мышей от 6 до 7 дней обоего пола.
   1. Приготовьте диссекционную среду для органотипической культуры срезов, состоящую (в мМ): 238 сахарозы, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1₂PO₄ и 11 глюкозы в деионизированной воде, затем газообразный с 5% CO₂/95% O₂ до pH 7,4.
   2. Готовят органотипические среды для срезов, состоящие из: 78,8% (v/v) минимально не....

Результаты

Рисунок 1: Два репрезентативных изображения стеклянной пипетки. (A) Отображайте пипетки с более низким сопротивлением (6,5 МОм), используемые в данном протоколе, и (B) пипетки с более высоким сопротивлением (1.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
очистки плазмид	Qiagen	12362
Подготовка органотипических культур для срезов
	Связующее	BD C150-UL
Измельчитель тканей McIlwain	TED PELLA, INC.	10180	Измельчитель тканей для приготовления органотипической культуры срезов
Вставка для клеточных культур Millicell, 30 мм	Вставки		многослойных PIHP03050 Вкладыши для органотипических культур срезов
Осмометр	Прецизионные системы	OSMETTE II
PTFE покрытые шпатели	Cole-Parmer	SK-06369-11
Ножницы	FST	14958-09
Стереомикроскоп	Olympus	SZ61
Стерильная система вакуумной фильтрации	Millipore	SCGPT01RE	Фильтрация и хранение aCSF
Электродный препарат
Капиллярные стекла	Warner Instruments	640796
Микропипеттер Съемник	Инструмент Саттера	P-1000	Съемник
Связующее	средство для духовки	BD (E2)
Съемник Инструмент	Саттера	FB330B	Съемник
Одноэлементная электропорация
3,5 мм Falcon Petri Посуда	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
Система электропорации	Молекулярные устройства	Аксопоратор 800А	Электропоратор

Набор для 6 лунок GREINER BIO-ONE 657160 Dumont #5/45 Щипцы FST#5/45 Угловые щипцы для препарирования органотипических культур срезов Фильтрующая установка колбы Миллипоры SCHVU02RE Фильтрация и хранение питательных сред Инкубатор для