Введение самоорганизующихся пептидов и нервных клеток-предшественников для восстановления спинного мозга в модели крысы

Аннотация

Источник: Zweckberger, K., et al. Синергетическое использование нейральных клеток-предшественников и самоорганизующихся пептидов при экспериментальном повреждении шейного отдела спинного мозга. J. Vis. Exp. (2015).

Этот протокол демонстрирует подход к целенаправленной инъекции для восстановления травмы спинного мозга на модели крысы. Он включает в себя доставку самоорганизующихся пептидов (САП) в ядро поражения для создания поддерживающего каркаса, за которым следуют инъекции нейральных клеток-предшественников (NPC) вокруг поражения для ремоделирования ткани.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарной экспертной комиссией JoVE.

1. Модель контузии/компрессии шейной аневризмы

шейного отдела позвоночника

1. Перед операцией используйте инструменты для автоклава и сохраняйте их стерильными в течение всей хирургической процедуры, поместив их в ванну с 70% содержанием спирта.
2. Обезболивайте крыс Вистар (250-270 г) комбинацией кислорода (O₂), закиси азота (N₂O) (1:1) и 1,8-2,2% изофлурана и поддерживайте спонтанное дыхание с помощью маски для газовой анестезии. Для индукции анестезии начните с 5% изофлурана в течение 1 минуты, а затем уменьшите. Перед началом операции контролируйте глубину анестезии, давая болевой раздражитель (например, в области лап). Наносите жирные мази в глаза, чтобы избежать сухости и предотвратить последующие инфекции.
3. Поместите крыс на нагревательную подушку (37 °C) и зафиксируйте голову в стереотаксическую рамку.
4. Побрейте операционную область вокруг шейного отдела позвоночника и продезинфицируйте повидон-йодом и 70% спиртом.
5. Сделайте разрез по средней линии над позвоночником от шейного позвонка (С2), доходя до выступающего отростка тела грудного позвонка 2 (Т2).
6. Разрежьте наружный слой позвоночных мышц непосредственно по средней линии (во избежание кровотечения) в кранио-каудальном направлении и далее рассекайте более глубокие слои мышц тупым путем, пока не дойдете до processus spinosus и пластинок. Вставьте втягивающие устройства.
7. Ориентируйте выступающий spinosus Processus тела позвонка T2 для наблюдения за целевыми уровнями для ламинэктомии. После идентификации и микрохирургического препарирования выбранных пластинок разрежьте связки флавы для ослабления пластинок и шиповидного отростка. Наконец, разрежьте пластинки ножницей для кости сбоку от спинного мозга и аккуратно удалите их, избегая сдавливания самого спинного мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее распространенными уровнями являются C5/6, C6/7 или C7/T1. Частота периоперационной летальности увеличивается с увеличением уровня травмы. Кровотечение из паравертебрального венозного синуса является распространенным явлением и может быть устранено путем тщательного сжатия губкой.
8. Прежде чем вставлять зажим для травмирования спинного мозга, определите появляющиеся нервные корешки, чтобы предотвратить их клипирование (особенно на уровнях C5/6).
9. Для того чтобы обеспечить плавную индукцию зажима, ослабьте вентральную твердую мозговую оболочку с дорсальной стороны тел позвонков с помощью крючка и подготовьте коридор для зажима.
10. Наконец, вставьте открытый зажим и дайте ему защелкнуться (быстрое закрытие), чтобы получить травму ушиба. Сила закрытия клипсы и продолжительность закрытия клипсы определяют интенсивность травмы и степень компрессии. Обычно используются усилия клипсования в диапазоне от 15 до 35 g и продолжительность клипсования, например, 1 мин. (рис. 1).
11. После снятия зажима адаптируйте мышцы в 2 слоя и закройте рану.
12. Прекратите анестезию и дайте животному проснуться под вашим непрерывным наблюдением, пока оно не придет в сознание, достаточное для лежачего состояния грудины. Наконец, поместите крысу в одну клетку и следуйте рекомендациям по послеоперационному лечению.
13. Поскольку животные борются с тяжестью этого типа травмы, вы должны обратить особое внимание на послеоперационное лечение:
    1. Вводите обезболивающие (Бупренорфин и Мелоксикам в течение 3 дней и 5 дней соответственно, и в соответствии с клиническими симптомами).
    2. Дают дополнительно солевой раствор подкожно в течение 3 дней (2 раза в день по 5-10 миллилитров (мл)).
    3. Вводите антибиотики в питьевую воду за 2 дня до и до 7 дней после операции (например, моксифлоксацин)
    4. Сжимайте мочевой пузырь 2-3 раза в день до тех пор, пока восстановление функции мочевого пузыря не станет постоянно очевидным
    .
    5. Наблюдайте за неврологическими нарушениями и физиологическим состоянием оперированных животных не реже одного раза в сутки.

2. Введение САП и NPC (через 14 дней после травмы)

1. Вызвать анестезию, как описано в пунктах 1.1 - 1.3, зафиксировать голову крысы в стереотаксической рамке, снять швы или раневые зажимы и продезинфицировать рану и операционную область с помощью повидон-йода и 70% спирта.
2. Тщательно рассеките паравертебральные мышцы, вставьте ретракторы, микроскопически удалите рубцовую ткань из твердой мозговой оболочки и повторно обнажите место поражения.
3. Приготовьте САП в концентрации 1% (мас./об.) для выполнения геля из внеклеточного матрикса. QL6 SAP имеют физиологически совместимый pH и не нуждаются в буферизации перед инъекцией. Для визуализации САП в спинном мозге используют флуоресцентное производное QL6 (QL6-флуоресцеин изотиоцианат [FITC]).
4. Введите САП (5 мкл (мкл) в центр поражения, распределенные 2 порциями, каждая по 2,5 мкл с обеих сторон от средней линии. Используйте шприц Гамильтона, соединенный со стереотаксической рамкой с микростеклянным капилляром (внешний диаметр 100 микрометров (μм) [OD]). Осторожно вскройте твердую мозговую оболочку кончиком острой иглы, и введите стеклянный капилляр стереотаксически на 2 миллиметра (мм) в травмированный спинной мозг.
5. После введения 1/3 объема извлеките иглу на глубину 1,5 мм, а еще через 1/3 до 1 мм. После введения всего объема, а также перед извлечением шприца, подождите 5 минут для стабилизации образования геля.
6. Чтобы получить NPC, используйте взрослых мышей с красным флуоресцентным белком (DsRed) дискосомой (или мышей с положительным желтым флуоресцентным белком [YFP], зелеными), изолируйте и культивируйте их из паравентрикулярной зоны.
7. Оцените жизнеспособность NPC с помощью окрашивания Trypan Blue, которое указывает на наличие ~90% живых клеток в клеточной суспензии. Разведите клетки в питательной среде (50 x 10 3 живых клеток/мкл), а затем используйте их для трансплантации клеток.
8. Сделайте четыре интраспинальные инъекции по 2 мкл (общий объем 8 мкл, содержащий 4 x 10⁵ NPC) двусторонне на 2 мм рострально и каудально от места травмы. После вскрытия твердой мозговой оболочки введите микростеклянный капилляр Гамильтона на 1,5 мм ниже дорсальной поверхности спинного мозга и введите 2 мкл клеточной суспензии. Выберите скорость впрыска около 0,5 мкл/мин (мин).
9. В конце каждой инъекции и перед удалением капилляра из спинного мозга подождите не менее 1 минуты, позволяя ткани растянуться, чтобы вместить новый объем клеток. (Рисунок 2)

Результаты

Рисунок 1: Модель контузии/компрессионной аневризмы клипсы. (А) Сфотографируйте через операционный микроскоп после ламинэктомии С7/Т1 и клипсовой контузии/компрессии спинного мозга крысы. (B) Изображение зажи...

Материалы