В этом видео демонстрируется оптогенетическое манипулирование нейронными цепями, участвующими в переходе от сна к бодрствованию у мышей. Процедура включает в себя хирургическую имплантацию оптического волокна и электродов в мозг и мышцы для обеспечения световой стимуляции и электрофизиологической записи. Доставляя свет для активации светочувствительных катионных каналов в ядре ложа терминальной полосы (BNST), нейронная активность модулируется, что позволяет исследователям анализировать сигналы мозга и мышц, связанные с индукцией бодрствования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптогенетическое манипулирование нейронными цепями для перехода от сна к бодрствованию у мышей
1.2K просмотров
⸱
29 августа 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Хирургия животных, инъекция вируса, электрод для ЭЭГ/ЭМГ и имплантация оптического волокна
ВНИМАНИЕ: Соответствующие методы защиты и обработки должны быть выбраны в зависимости от уровня биобезопасности используемого вируса. Аденоассоциированный вирус (AAV) следует использовать в изолированном помещении для инъекций с классификацией P1A, а трубку, содержащую AAV, необходимо стерилизовать автоклавом после того, как весь объем будет израсходован. Место операции и весь имплантируемый материал должны быть чистыми и стерильными во время использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Рисунок 1.
1. Продезинфицируйте хирургическое оборудование с помощью автоклава.
2. Обезболите мышей изофлураном с помощью анестетического вапорайзера. Наблюдайте до тех пор, пока мышь не достигнет нужной глубины анестезии, определяемой потерей реакции на защемление хвоста щипцами. Наносите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить их пересыхание.
3. Продезинфицируйте операционное поле раствором йода или 70% этанолом (EtOH, 3x) и достаточно высушите. Дайте вирусу оттаять на льду во время проведения операции. Накройте операционную область впитывающей лабораторной бумагой.
4. Зафиксируйте голову мыши в стереотаксическом аппарате с помощью ушных планок и зажима для носа. Убедившись, что головка держится стабильно, сделайте среднесагиттальный разрез на волосистой части головы, чтобы убедиться, что положения брегмы и лямбды расположены на одном уровне по горизонтальной линии.
5. Чтобы избежать разрыва в позиционировании, соответствующим образом отрегулируйте уровни зажима носа и ушных планок вверх и вниз. Брегма и лямбда относятся к пересечению между sutura saggitalis и sutura coronalis или sutura lambdoidal, соответственно (рис. 2).
6. Используйте серафиновые зажимы для удержания кожи, чтобы сохранить доступ к черепной коробке. После воздействия на череп продезинфицируйте поверхность черепа йодом или 5% H2O2, чтобы черепные швы, включая брегму и лямбду, могли быть визуализированы более четко.
7. Подготовьте векторное внедрение AAV:
1. Промойте внутреннюю часть шприца объемом 10 мл (см. Таблицу материалов) последовательно 70% EtOH, 100% EtOH и стерилизованной водой, 5 раз каждая. Закрепите шприц в зажиме рычага микроинжекционного насоса и убедитесь, что весь раствор в шприце вылит.
2. Осторожно отсасывайте 2 μL минерального масла без пузырьков воздуха, затем отсасывайте назначенный объем раствора вируса. После аспирации манипулируйте кнопкой поршня и убедитесь, что раствор вируса выходит на кончике иглы.
Объем инъекции раствора вируса был определен в пилотных экспериментах с использованием того же штамма мыши и того же вирусного продукта. Соотношение между объемом вирусного раствора и площадью заражения должно быть оценено заранее.
8. Вставьте AAV vector:
1. Отрегулируйте кончик иглы для микроинъекций на брегме и запишите координаты в качестве исходной точки. Переместите наконечник в обозначенное место инъекции (для БНСТ: переднезадний + 0,2 мм, медиолатеральный ± 1,0 мм, дорсовентральный - 4,2 мм) и установите кончик иглы в нужное положение. Нанесите отметку на череп и просверлите отверстия диаметром примерно 2 мм с помощью стоматологической бормашины с твердосплавной фрезой диаметром 0,7 мм. Будьте осторожны, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку или мозговую ткань.
2. Удалив кровь вокруг отверстий с помощью ватного тампона, медленно переместите иглу в положение BNST. Медленно вводите указанное количество раствора вируса (0,07 мкл/мин) с помощью механического микроинъектора. После завершения инъекции оставьте иглу на 5 минут, чтобы раствор достаточно проник в ткани BNST. Аккуратно извлеките иглу.
3. Для двусторонних инъекций повторите шаги 1.8.1-1.8.2 с другой стороны. На протяжении всей процедуры применяйте стерильный физиологический раствор, чтобы сохранить череп влажным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали специальные имплантаты для электроэнцефалографии (ЭЭГ)/электромиографии (ЭМГ) (ширина: 5 мм, глубина: 7 мм, высота: 1 мм) с четырьмя электродами ЭЭГ (4 мм), двумя электродами ЭМГ (2 мм; обрезать электрод 4 мм до 2 мм кусачками) и 6 электродами (4,5 мм) (Рисунок 2А).
9. Припаяйте два провода из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов), с которых с обоих концов сдирается 1 мм изоляции к электродам ЭМГ. Отрегулируйте центр электродов относительно брегмы, отметьте положение каждого электрода ЭЭГ (переднезадний ± 1,5 мм, медиолатеральный ± 1,0 мм) и определите положение имплантата (рисунок 2В).
10. Имплантируйте оптические волокна:
1. Прикрепите к манипулятору оптоволоконный наконечник и поверните манипулятор так, чтобы он имел угол ±30° относительно горизонтальной линии (этот процесс необходим только для того, чтобы избежать помех между электродами и оптическими волокнами, например, в случае стимуляции BNST). Наденьте наконечник волокна на брегму и запишите координаты.
2. Переместите кончик к целевой линии вставки и отметьте положение на черепе. Кроме того, поставьте дополнительные метки рядом с местом вставки для анкерных винтов. Просверлите череп на каждом участке с помощью стоматологической бормашины, чтобы вставить оптическое волокно и зафиксировать винт. Закрепите винт на черепе. Будьте осторожны, чтобы не сломать твердую мозговую оболочку и не повредить ткань винтом.
3. Аккуратно вставьте оптическое волокно, пока не достигнете манипулятором выше BNST. Наконечник должен опираться на оставшуюся черепную коробку (рисунок 1B).
4. Нанесите фотоотверждаемый стоматологический цемент (см. Таблицу материалов), чтобы покрыть волокно и винт. Время реакции для затвердевания клея должно быть указано в инструкции производителя (Наш материал должен подвергаться воздействию света не менее 10 секунд с фотогенераторами определенной длины волны. После этого высыхать клей не нужно).
5. На этом шаге убедитесь, что никакие материалы (винты или клей) не занимают место для крепления электродов. Кроме того, избегайте прерывания цемента для наконечника, соединяющегося с оптическим волокном и кабелем. Повторите шаги 1.10.1-1.10.4 с противоположной стороны для двусторонней стимуляции.
11. Просверлите отверстия для электродов ЭЭГ/ЭМГ. Вставьте кончики электродов в отверстия. Удерживайте имплантат и нанесите цианоакрилатный клей на пространство между черепом и электродами. Вставьте еще раз с осторожностью, чтобы не повредить какие-либо материалы.
12. Покройте окружность электродов и оптических волокон цианоакрилатным клеем с последующим нанесением на клей цианоакрилатного ускорителя. Этот шаг позволяет избежать прерывания работы в зоне соединения кабель-кабель и электрод-провод (рис. 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Цианоакрилатный клей и его ускоритель вредны для мышиного глаза. Следите за тем, чтобы не допустить разлива этих химических веществ. Кроме того, будьте осторожны и не прикасайтесь сильно к электродам и волокнам, чтобы избежать неожиданных отклонений сразу после затвердевания клея.
13. Обнажите мышцы шеи мыши и вставьте провода для электрода ЭМГ под мышцу. Отрегулируйте длину электрода ЭМГ так, чтобы он располагался как раз под затылочными мышцами. Достаточно легкого соединения между кончиком электрода и мышечной фасцией, чтобы поймать сигнал ЭМГ.
14. Нанесите цианоакрилатный клей для заполнения имплантатов и затвердейте клей с помощью ускоряющей жидкости. Затем положите мышь на грелку для восстановления до появления постурального рефлекса. Отрегулируйте температуру грелки в соответствии с температурой тела животного в состоянии покоя (36,0 °C в ZT 0-12 для мышей C57BL6; не превышайте 38,0 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотик не требуется для стерильной хирургии. Следуйте рекомендациям местного учреждения по послеоперационной анальгезии. Держите мышей в домашней клетке в течение восстановительного периода не менее 7 дней.
2. ЭЭГ/ЭМГ мониторинг с фотовозбуждением целевых нейронов в определенных состояниях сна
ВНИМАНИЕ: Этот протокол включает использование лазерного оборудования класса 3B или светодиодных устройств. Экспериментаторы должны быть осведомлены об информации по технике безопасности. Необходимы защитные очки для глаз.
1. Перед подключением лазерного кабеля к оптическому волокну отрегулируйте интенсивность лазера с помощью скалера. Привяжите наконечник лазерного кабеля к неиспользуемому оптическому волокну с помощью наконечника и убедитесь, что на стыке между волокном и кабелем нет места.
2. Включите главный выключатель лазера и подождите 20 минут, пока он нагреется.
3. Излучаем лазер на средство проверки интенсивности и регулируем интенсивность лазера до 10 мВт/мм2. Измените режим лазера на транзисторную логику и убедитесь, что световые импульсы излучаются из волокна, управляемого регулятором диаграммы направленности, который установлен на 10 мс для длительности, 40 мс для покоя, 20 раз для цикла и 20 раз повторите (то есть 20 Гц из 10 мс световых импульсов в течение 20 с).
4. После восстановительного периода переместите мышей в экспериментальную камеру для записи ЭЭГ/ЭМГ. Домашних мышей содержали при постоянной температуре 23 °C с 12-часовым циклом свет/темнота с пищей и водой, доступными в неограниченном количестве.
5. Подсоедините имплантированный электрод и кабельный адаптер, который привязан к контактному кольцу, чтобы избежать запутывания. Рекомендуется закрыть место соединения светонепроницаемым материалом, таким как алюминиевая фольга, чтобы предотвратить утечку лазера. Если требуется двусторонний эксперимент, используйте для кабелей контактное кольцо с бифуркационным креплением.
6. В этом протоколе мы оцениваем задержку до пробуждения от сна без быстрого движения глаз (NREM) или сна с быстрым движением глаз (REM), поэтому время записи должно быть ограничено в оптимизированном времени времени (ZT0 определяется как время, когда свет включен). Этот протокол проводился между ZT4 и ZT10. Дайте мышам свободно оставаться в экспериментальной камере не менее 1 ч в качестве акклиматизации.
7. В течение экспериментального периода отслеживайте сигналы ЭЭГ и ЭМГ на одном мониторе и оценивайте состояние мыши как бодрствование, быстрый сон или быстрый сон. Используйте регулятор усиления для каждой волны, чтобы было легче различать каждое состояние.
8. Для измерения задержки NREM-сна и бодрствования наблюдайте за стабильным NREM-сном в течение 40 с или стабильным быстрым сном в течение 30 с, затем включите переключатель генератора паттернов для фотостимуляции (этот протокол генерирует 20 Гц световых импульсов 10 мс в течение 20 с). Подтвердите лазерное излучение на имплантированные оптические волокна.
9. Записывайте сигналы ЭЭГ/ЭМГ до тех пор, пока состояние сна не перейдет в бодрствование. Если необходимо провести два или более экспериментальных испытания, ограничьте оптогенетические манипуляции до одного раза в день, поскольку фотостимуляция является искусственным вмешательством, которое может повлиять на архитектуру сна/бодрствования.
10. После эксперимента провести глубокую анестезию и перфузию стерильным физиологическим раствором и параформальдегидом (ПФА) для забора всего мозга для иммуногистохимического анализа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1: Процедура введения AAV, имплантации оптических волокон и имплантатов ЭЭГ/ЭМГ. (А) Экспериментальная процедура введения вируса. EYFP-слитый ген ChR2 или EYFP (для контроля), включенный в вектор AAV, транскрипция...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1x1 Волоконно-оптические вращающиеся соединения | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | для оптогенетики |
| 6-контактный разъем | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-контактный разъем | Hirose | 21602X3GSE | |
| Аналого-цифровой преобразователь | Nippon koden | N/A | Аналого-цифровой преобразователь |
| AAV_{10} -EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×10^{13} (геномных копий/мл) | ||
| AAV_{10} -EF1a-DIO-EYFP | 5.82×10^{13} (геномных копий/мл) | ||
| Ампициллин | Fuji пленка | 014-23302 | |
| Усилитель | Nippon koden | Н/Д | для записи ЭЭГ/ЭМГ |
| Анестетический испаритель | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Автоматический инжектор | KD Scientific | 780311 | |
| Твердосплавный резак | Minitor | B1055 | φ0.7 мм. Используется как стоматологическая бормашина, используется с высокоскоростным роторным микромотором |
| Цианоакрилатная адгезия (Арон альфа А) и ускорение | Konishi | #30533 | |
| Стоматологический отверждающий свет | 3M | Elipar S10 | |
| Эпоксидный клей | Konishi | #04888 | изоляция вокруг припоя 6-контактного и экранированного кабеля |
| Волоконно-оптический патч-корд (разветвление) | Doric BFP(#)_50/125/900-0.22 | ||
| Мыши GAD67-Cre предоставлены | доктором Кенджи Сакимура | Ген рекомбиназы Cre вбит в аллель Gad67 | |
| Шприц Hamilton | Hamilton | 65461-01 | |
| Комплект высокоскоростного роторного микромотора | FOREDOM | K.1070 | Используется с твердосплавным резцом |
| Соединительная втулка | Thorlab | ADAF1 | φ2,5 мм Керамический |
| изофлуран | Pfizer | 871119 | |
| лазер Rapp | OptoElectronic | N/A | 473 нм длина |
| Проверка интенсивности лазера | COHERENT | 1098293 | |
| Лазерный стимулятор | Биоисследовательского центра | STO2 | в качестве генератора импульсов в тексте |
| Оптическое волокно с наконечником | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | предоставлено PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | пластимид # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | предоставлен доктором Карлом Дайссеротом | ||
| Патч-корд | Doric | D202-9089-0.4 | длина 0,4 м, лазерный проводник между лазером и вращающимся соединением |
| pHelper | Stratagene | ||
| Фотоотверждаемый стоматологический цемент | 3M | 56846 | |
| Серафиновый зажим | Stoelting | 52120-43P | |
| Экранированный кабель | mogami | W2780 | Пайка к 6-контактному гнезду для записи ЭЭГ/ЭМГ |
| Камера для записи сна | Н/Д | /Д | Custum made (21см× 29см × 19см) с держателем резервуара для воды |
| Программное обеспечение для сна | KISSEI COMTEC | N/A | для анализа ЭЭГ/ЭМГ |
| Контактное кольцо | для нейронауки, включая | Н/Д | для анализа ЭЭГ/ЭМГ |
| Винт из нержавеющей стали | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Нержавеющий провод | Проволока Кунера | AS633 | диаметр 0.0130 дюйма |
| Стереотаксическая рама с цифровой консолью | Koph | N/A | Модель 940 |
| Игла для шприца | Hamilton | 7803-05 | |
| Программное обеспечение регистратора жизненно важных функций | KISSEI COMTEC | Н/Д | для записи ЭЭГ/ЭМГ |
