Стимуляция блуждающего нерва с помощью хронически имплантируемых электродов манжеты периферических нервов у крыс

Аннотация

Источник: Sanchez, C. A., et al. Подготовка электродов для стимуляции периферических нервов для хронической имплантации у крыс. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется стимуляция блуждающего нерва у бодрствующей крысы. Крыса с имплантированным электродом манжеты хронического периферического нерва и обученная задаче нажатия рычага, подключена к генератору стимулов через имплантированную головную крышку. Блуждающий нерв стимулируется сразу после каждого успешного нажатия на рычаг, что приводит к расширению моторной карты.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Стимулирование изготовления манжетных электродов

1. Подготовьте трубку манжеты.
   1. С помощью лезвия бритвы отрежьте кусок полимерной трубки длиной 2,5 мм. Вставьте наконечники щипцов или скрепку через трубку и с помощью лезвия сделайте продольный разрез через стенку трубки с одной стороны манжеты.
   2. Извлеките щипцы из трубки и вставьте большую швейную иглу через среднюю линию манжеты, перпендикулярно длинной оси. Вставьте иглу через щель (вверху) и в центр трубки напротив (снизу). Поместите иглу в пенопластовую доску, чтобы закрепить манжету на месте во время остальных этапов сборки.
2. Наложите шов для фиксации закрытия манжеты во время имплантации.
   1. Вставьте маленькую швейную иглу через стенку манжеты, по средней линии, примерно в 0,5 мм от верхнего разреза с одной стороны. Вставьте иглу изнутри наружу, чтобы не повредить трубку манжеты. Вставьте шов длиной 2 см 6/0 через ушко иглы и протяните иглу через стенку трубки, чтобы продеть шов в манжету.
   2. Оставив нить на месте, извлеките иглу и проколите второе отверстие через стенку трубки примерно на 0,5 мм ниже первого отверстия, по средней линии манжеты. Вставьте шов через ушко иглы и протяните иглу через стенку трубки, чтобы снова продеть шов через манжету.
   3. Теперь оба конца шовной нити должны находиться на внешней стороне манжеты. Отрегулируйте шов так, чтобы ~1,5 см выходил из верхнего отверстия и ~0,5 мм из нижнего отверстия.
   4. Нанесите небольшое количество клея УФ-(ультрафиолетового) отверждения на короткий конец шовной нити, проходящий от нижнего отверстия, и потяните более длинный конец шовной нити до тех пор, пока нижний хвост не окажется почти вровень с внешней стенкой трубки. Используйте УФ-палочку, чтобы отверждать клей и надежно удерживать шов на месте.
   5. Повторите шаги с 1.2.1 по 1.2.3 на противоположной стороне манжеты.
3. Установите провода Platinum:Iridium (Pt:Ir).
   1. Используйте маленькую швейную иглу, чтобы сделать 4 отверстия в стене манжеты. Каждая пара отверстий должна располагаться примерно в 0,5–0,8 мм от перпендикулярной средней линии, с отверстием примерно в 0,5–0,8 мм от верхней щели по обе стороны от манжеты.
      ВНИМАНИЕ: Для наиболее последовательного и точного размещения выводов вставьте иглу изнутри наружу, чтобы сделать все отверстия, Используя расположение швов в качестве ориентира.
   2. Снова вставьте швейную иглу, на этот раз двигаясь снаружи внутрь через свинцовое отверстие 1. Вставьте примерно 0,5 см из 7,5 см проволоки Pt:Ir через ушко иглы и протяните иглу через трубку, чтобы продеть проволочный провод через стенку манжеты. Отрегулируйте проволоку так, чтобы ~4,5 см выступала на внешней стороне манжеты (Рисунок 1A).
   3. Снова вставьте иглу через свинцовое отверстие 1, снова работая снаружи внутрь, и дополнительно вставьте иглу через свинцовое отверстие 2 прямо напротив свинцового отверстия 1. Вставьте ~0,5 см более короткого (внутреннего) конца провода Pt:Ir через ушко иглы и протяните иглу через трубку, чтобы продеть провод через стенки манжеты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь оба конца провода Pt:Ir должны находиться на внешней стороне манжеты, а вокруг края разреза и через свинцовое отверстие 1 образуется проволочная петля (рис. 1B).
   4. Повторите шаги с 1.3.1 по 1.3.3, чтобы проложить провод Pt:Ir через выводные отверстия 3 и 4.
   5. С помощью бутановой зажигалки осторожно снимите изоляцию длиной 5–6 мм на конце проводов Pt:Ir, идущих от свинцового отверстия 2 и свинцового отверстия 4,
      ВНИМАНИЕ: Осторожно изолируйте концы проводов от остальной части манжеты в сборе, чтобы не повредить манжету. Используйте инструменты для удержания проводов, чтобы избежать травм.
   6. Выровняйте оголенный провод внутри манжеты, чтобы разместить провода на своих конечных местах. Для этого осторожно потяните за конец провода Pt:Ir, идущего от отверстия 1 до тех пор, пока неизолированная часть провода не окажется на одном уровне с отверстием 1. Повторите то же самое с другим выводом, чтобы выровнять неизолированный конец провода, продетый через отверстия 3 и 4.
   7. Нанесите небольшое количество клея с УФ-отверждением на проволочные петли на внешней стороне манжеты в ведущих отверстиях 1 и 3. Используйте УФ-трубку, чтобы отверждать клей и закрепить провода на месте.
   8. С помощью небольшого наконечника пипетки прижмите неизолированные провода Pt:Ir к внутренней стенке манжеты. После того, как провода будут на месте, обрежьте концы проводов, выходящих из выводных отверстий 2 и 4, так, чтобы примерно 1 мм провода выходил за пределы внешней стороны стенки манжеты.
   9. Загните хвостики проволоки толщиной 1 мм к внешней поверхности манжеты, стараясь не укоротить их вместе. Нанесите небольшое количество клея UV-отверждения, чтобы покрыть только два хвоста, и отверждите клей, чтобы закрепить размещение свинца и обеспечить электрическую изоляцию.
      ВНИМАНИЕ: Важно полностью покрыть внешние поверхности Pt:Ir клеем, чтобы изолировать провода и избежать нецелевого воздействия.
4. Закрепите провода Pt:Ir на месте с помощью шовного материала.
   1. Удалите большую иглу с манжетой в сборе из пенопласта. Вставьте шовный материал длиной 3/0 6/0 через ушко иглы и протяните иглу через трубку, чтобы продеть шов через нижнюю часть манжеты в средней точке.
   2. Переключитесь на маленькую швейную иглу, чтобы завершить заправку нити для фиксации отведения Pt:Ir. Вставьте иглу через то же отверстие по средней линии, снова двигаясь изнутри наружу, чтобы избежать деформации трубки и проводов провода. Вставьте внешний хвост шовной нити через игольное ушко и протяните иглу через стенку манжеты, чтобы создать петлю из шовной нити по краю манжеты (Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте щипцы и работайте под микроскопом, чтобы убедиться, что шов ориентирован вдоль длинной оси манжеты и прилегает ровно к трубке. Этот шаг гарантирует, что провода остаются разделенными на внутренней стороне манжеты и удерживаются на месте сбоку от средней линии манжеты.
   3. Создайте вторую петлю вокруг противоположного конца манжеты, завязав концы шва в полуузел, на внешней стороне манжеты. Убедитесь, что шов проходит вдоль длинной оси манжеты и прилегает ровно к трубке. Крепко держа узел так, чтобы он плотно прилегал к трубке, нанесите небольшое количество клея УФ-отверждения на полуузел и затвердите, чтобы удержать на месте.
   4. Аккуратно обрежьте концы шовной нити как можно ближе к узлу. При необходимости используйте небольшое количество дополнительного клея для УФ-отверждения, чтобы приклеить короткие концы шовной нити так, чтобы они лежали ровно на трубке (Рисунок 1D).
5. Припаяйте контакты разъема к проводам Pt:Ir.
   1. Используя бутановую зажигалку, снимите изоляцию с ~3 мм на конце каждого из проводов Pt:Ir. Припаяйте сторону чашки золотого штифта (см. Таблицу материалов) к неизолированному концу каждого провода.
6. Проверьте импеданс собранного устройства.
   1. Подключите золотые контакты к входам измерителя LCR (Индуктивность (L), Емкость (C) и сопротивление (R)) или модуля проверки импеданса электрода и установите частоту тестирования на 1 кГц. Погрузите трубку манжеты (и контакты стимуляции Pt:Ir внутри манжеты) в небольшой стакан, наполненный физиологическим раствором, следя за тем, чтобы золотые свинцовые штифты и разъемы щупов оставались сухими. Перед началом имплантации убедитесь, что собранная манжета имеет импеданс на частоте 1 кГц менее 2 кОм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокий импеданс часто указывает на недостаточную площадь поверхности Pt:Ir, которая может возникнуть из-за таких факторов, как недостаточное удаление изоляции, случайное нанесение клея на внутреннюю часть манжеты, обрыв жил провода, и так далее. Манжеты также следует осматривать на предмет обрывов или неправильно расположенных жил проволоки, которые могут привести к коротким контактам при длительном использовании.

2. Конструкция крышки головы

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры сборки крышки аналогичны опубликованным ранее и кратко изложены здесь для удобства.

1. Собери колпак для головы
   1. Вырежьте два маленьких кусочка проволочной обмотки 30 AWG (American Wire Gauge), один ~13 мм в длину и один ~10 мм в длину. Снимите ~1,5 мм изоляции с каждого конца обоих проводов. Припаяйте штырьковую сторону золотого штифта к одному концу каждого провода, как можно ближе к чашке. С помощью кусачек отрежьте лишнюю длину штифта за пределами паяного соединения.
   2. Припаяйте другие концы проводов AWG к двум центральным паяльным чашкам 4-контактного микрополоскового разъема.
   3. Согните провода напорной крышки провода вверх по направлению к разъему и прижмите золотые контакты к разъему параллельно друг другу, как показано на рисунке 2A. Контакт, подключенный к более короткому проводу, должен быть расположен ниже контакта, подключенного к более длинному проводу. Используйте акрил для ногтей, стоматологический цемент или клей УФ-отверждения, чтобы закрепить провода колпачка на месте.

3. Использование устройства

1. Имплантируйте электроды манжеты для стимуляции хронического блуждающего нерва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические процедуры должны выполняться с использованием стерильной или асептической техники под соответствующей анестезией, в соответствии с Рекомендациями NIH (Национальные институты здравоохранения) по уходу и использованию лабораторных животных и с одобрения местного IACUC (Институциональный комитет по уходу и использованию животных). Следующие процедуры предназначены для иллюстрации репрезентативного использования устройства и не являются исчерпывающими.
   1. Поместите крысу в стереотаксическую рамку и сделайте сагиттальный разрез над теменной и затылочной костями, чтобы открыть поверхность черепа для имплантации головного колпачка/соединителя. Аккуратно просверлите 4 отверстия в черепе и установите ювелирные винты. Используйте стоматологический акрил, чтобы закрепить колпачок на черепе и винтах.
   2. Снимите крысу со стереотаксической рамки и положите ее на правый бок. Сделайте вертикальный разрез на коже с левой стороны шеи, и аккуратно рассеките левый блуждающий нерв от сонной артерии, расположенной между грудино-сосцевидной и грудиноягодной мышцами и под подъязычной мышцей.
   3. Туннельная манжета ведет подкожно к черепу. Соедините провода с колпачком с помощью золотых штифтов.
   4. Поместите блуждающий нерв внутрь манжеты и зафиксируйте устройство закрытым, завязав двойной узел в швах манжеты. Будьте осторожны, чтобы не повредить нерв во время имплантации, манипулируя нервом тупыми непроводящими крючками или захватывая соединительную ткань, окружающую нерв.
   5. Протестируйте имплантат путем применения стимуляции к устройству (последовательность двухфазных импульсов 10 с 0,8 мА, 30 Гц, 100 μс). Правильная имплантация приведет к остановке дыхания и снижению SpO₂ (сатурация периферических капилляров кислородом) на 5% и более.
   6. Покройте золотые штифты и открытые отвести стоматологическим акрилом, закройте раны швами, а места разрезов очистите физиологическим раствором, спиртом и раствором повидон-йода.
   7. Обеспечьте замену жидкостей, анальгетиков и послеоперационный уход в соответствии с рекомендациями NIH и одобрением IACUC.
2. Стимулируйте блуждающий нерв во время бодрствования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее было показано, что стимуляция блуждающего нерва (VNS) при выполнении животными определенных двигательных задач расширяет представление моторной карты мускулатуры, связанной с задачей. Мы используем эту проверенную парадигму для получения репрезентативного примера использования устройства, но многие другие поведенческие парадигмы и/или параметры стимуляции могут иметь отношение к альтернативным приложениям. Крысы были обучены навыкам выполнения задачи рычажного пресса, используемой здесь, до имплантации устройства. После операции хорошая производительность была снова подтверждена до доставки VNS: крысы провели не менее 100 успешных испытаний в ходе двух 30-минутных тренировок в день. VNS сочеталась с правильными жимами рычагов в течение 10 последующих тренировок в течение 5 дней.
   1. Подключите крысу к генератору стимулов через имплантированную головную шапочку и настройте соответствующие настройки стимуляции. Для индуцированной VNS реорганизации моторной кортикальной карты сопряжение каждого правильного рычажного нажатия с одной последовательностью из 15 двухфазных импульсов, каждый с шириной 100 μс и амплитудой 800 μА, подаваемых с частотой 30 Гц.
   2. Стимулирующий шлейф подается сразу после обнаружения каждого успешного нажатия на рычаг в течение десяти 30-минутных тренировок. Во время подачи VNS используйте осциллограф для контроля успешной подачи токовой стимуляции.
3. Валидация функции хронически имплантируемой манжеты.
   1. В течение 24 часов после последней парной тренировки VNS, используйте внутричерепную микростимуляцию (ICMS) для количественной оценки функциональной соматотопической карты в моторной коре.
   2. После индукции анестезии для картирования моторной коры головного мозга с помощью ICMS снова подтвердите функцию манжеты, применяя 10-секундную последовательность токовой стимуляции с частотой 30 Гц, 0,8 мА (двухфазные импульсы 100 μс), что должно привести к остановке дыхания и снижению уровня_SpO2 не менее чем на 5%, что соответствует рефлексу Геринга-Брейера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от области применения, функция манжеты может считаться приемлемой, если наблюдается надежное падение_SpO2 менее чем на 5% или если более высокие амплитуды тока (до 1,6 мА) обеспечивают надежное снижение_SpO2 не менее чем на 5%. Отсутствие остановки дыхания и/или достоверное снижение_SpO2 свидетельствует об отторжении имплантата.

Результаты

Рисунок 1: Сборка стимулирующих электродов манжеты. (A) После наложения швов с обеих сторон манжеты, проволоку Pt:Ir можно продеть через стенку манжеты в отверстие #1 (белый наконечник стрелы) с помощью швейной иглы. (B) Pt:Ir провод правильн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Биосовместимая полимерная трубка на основе полиуретана, 0,080" OD x 0,040" ID	Braintree Scientific	MRE080 36 FT
Препарирующий микроскоп	AM Scopes	#SM-6T-FRL
Тонкие зубчатые ножницы, прямые, Режущая кромка 22 мм	Fine Science Tools	#14058-09	для резки Pt/Ir проволоки и шовной нити
Щипцы, #5 Пинцы Дюмона, прямые, 11 см, 0,1 x 0,06 мм наконечник	Fine Science Tools	#11626-11
Щипцы, щипцы с керамическим наконечником, наконечники 0,3 мм x 30 мм Электронная	микроскопия Sciences	#78127-71
Золотые штифты, печатные платы Press Fit Socket	Mill-Max	#1001-0-15-15-30-27-04-0	или аналогичные маленькие штыри для подключения манжеты к головке
зажигалки Изобутан	BIC	#LCP21-AST	для деизолирующего провода Pt/Ir
Микроразъем с защелкой, 4-контактный	Omnetics	A24002-004 / PS1-04-SS-LT
Наконечник для пипетки, 10 мкл	VWR	89079-464
Платина-иридиевая (90/10%) проволока, 0,001" (диаметр) x 9 жил,	Sigmund Cohn	10IR9/49T
однолезвие, хирургическая углеродистая сталь No9	VWR	#55411-050	для резки трубки MicroRenathane трубка
Швейная игла, ок. 4,0 см длина x 0,7 мм диаметр (размер 6-7)	Singer	276	Меньшая игла для заправки нитки Pt/Ir проволока
Швейная игла, ок. 4,5 см длина x 0,8 мм диаметр (размер 2-3)	Singer	276	Большая игла для закрепления манжеты при сборке и для продевания нити
Маленькая пенопластовая доска	Juvo+/Amazon	B07C9637SJ	для производственной платформы; наши размеры ок. 2,5" x 3,5" x 1" (Д x Ш x В)
Припой, многожильный бессвинцовый, диаметр 0,38 мм	Loctite/Multicore	#796037
Паяльная станция	Weller	WES51	или аналогичный паяльник, совместимый с длинными коническими жалами (эта деталь снята с производства)
Жало паяльное, длинное коническое, 0,01" / 0,4 мм	Weller	1UNF8
Шовный материал, нерассасывающийся плетеный шелк, размер 6/0	Fine Science tools	#18020-60
UV (405 нм) прожектор	Henkel/Loctite	#2182207
UV Light Cure Клей 25 мл	Henkel/Loctite	AA 3106	или аналогичный биосовместимый УФ-отверждаемый клей
Проволока для обмотки, 30 AWG	Digikey	K396-ND

Бритвенное лезвие с изоляцией из ПТФЭ,