Вирус-опосредованный перенос генов в дорсальное кохлеарное ядро мыши для индуцированной светом слуховой стимуляции

Аннотация

Источник: Kozin, E. D., et.al. Прямая визуализация дорсального кохлеарного ядра мыши для оптогенетической стимуляции слухового пути. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео демонстрируется вирус-опосредованный перенос генов в дорсальное кохлеарное ядро мыши (DCN) для обеспечения световой стимуляции слуха. Вирусный вектор, кодирующий опсин, светочувствительный ионный канал, вводится в DCN после трепанации черепа и мозжечковой аспирации для прямого доступа. Экспрессированные опсины позволяют нейронам активироваться светом, обеспечивая модель для изучения реакций слуховых путей с использованием оптогенетики.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Мозжечковое стремление

1. Используя 5 французских всасываний, аспирируйте самую латеральную часть левого мозжечка, расположенную над DCN, пока DCN не станет визуальной (Рисунок 1, Правая панель). Удалите примерно от 1/4 до 1/3 левого мозжечка. Основным ориентиром, прилегающим к DCN, является ампула верхнего полукружного канала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация мозжечка является ключевым этапом протокола. Направленная аспирация мозжечка наиболее успешна в том случае, если она происходит с одной попытки, а не с многократными проходами отсасывания, так как это вызовет кровотечение. Чтобы помочь в аспирации, установите фокальную плоскость микроскопа на ожидаемой глубине ЦН, которая будет немного дистальнее поверхности мозжечка. Установка фокальной плоскости на КН улучшит визуализацию и обеспечит четкое изображение.
2. После аспирации ожидается дальнейшее кровотечение, накопление спинномозговой жидкости (ликвора) и смещение мозжечка на DCN. Быстро введите 0,5 мл стерильного физиологического раствора в трепанацию черепа, чтобы предотвратить свертывание крови. Затем можно использовать комбинацию осторожного промакивания зубной точкой и отсасывания, чтобы расчистить путь для прямой визуализации DCN. Не соприкасайтесь непосредственно с поверхностью DCN.

2. Микроинъекция давления для вирус-опосредованного переноса генов и хирургического восстановления

1. После того, как DCN освободится от вышележащей крови и ликвора и станет хорошо видимой, сделайте микроинъекции давления в DCN с помощью шприца Hamilton объемом 10 мкл в течение 2 минут.
2. Вводите иглу с помощью микроманипулятора до тех пор, пока кончик не перестанет быть виден под поверхностью ДЦН.
3. Для оптимальной производительности используйте иглу 33 или 34 калибра (используйте газонепроницаемый шприц с иглой 34 калибра) с неглубоким скосом, например, 45°, чтобы свести к минимуму тупую травму и локализовать объем инъекции в DCN, который представляет собой тонкую и неглубокую структуру ствола мозга (толщиной <300 мкм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другие инструменты для микроинъекций. В идеале инструмент для впрыска должен быть достаточно гибким, чтобы при необходимости допускать небольшой изгиб для прямого нацеливания на DCN. Кроме того, поскольку мышь слегка двигается на протяжении всей процедуры из-за дыхания, инструмент должен быть достаточно прочным, чтобы выдерживать незначительные движения.

3. Хирургическое восстановление

1. Сразу после инъекции повторно приблизьте кожу и дайте мышке восстановиться в соответствии со стандартной процедурой восстановления. Оставшаяся мозжечковая и рубцовая ткань заполнят полость, вызванную аспирацией мозжечка. Постоянно наблюдайте за животными до тех пор, пока не будет восстановлено сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Следите за частотой сердечных сокращений, частотой дыхания, а также способностью к кормлению.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ни одно животное, перенесшее операцию, не возвращается в клетку с другими животными до полного выздоровления.
2. Если мышь начинает ходить кругами после операции (<5% случаев), обычно через 2-4 часа после закрытия разреза кожи, немедленно принесите мышь в жертву, так как ей, вероятно, будет трудно питаться. Этот побочный эффект, вероятно, связан с аспирацией мозжечка. Животное должно находиться под наблюдением на предмет боли после операции, и должны быть назначены соответствующие препараты для обеспечения комфорта животного на основе институциональных стандартов. Антибиотики могут быть необходимы, если есть признаки инфекции.

Результаты

Рисунок 1: Частичная мозжечковая аспирация демонстрирует доступ к дорсальному кохлеарному ядру. Левая панель: После того, как мышь помещена в держатель, делается вертикальный разрез через кожу и мягкие ткани вдоль задней части черепа до мягких т...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стереотаксический держатель	Stoelting	51500
5 французских отсосов	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 μl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14