Регенерация аксонов в седалищном нерве мыши после раздавливания

Аннотация

Источник: Li, Q., et al. Исследование регенерации аксонов млекопитающих: электропорация in vivo ганглия заднего корешка взрослой мыши. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется процесс регенерации аксонов в седалищном нерве мыши после раздавливания. Изолированный нерв фиксируется и подготавливается к визуализации, а флуоресцентные белки экспрессируются в нейронах для визуализации роста аксонов. С помощью эпифлуоресцентного микроскопа прослеживается регенерация аксонов от места повреждения для оценки степени повторного роста.

Протокол

1. Материалы и реагенты

1. Животные
   1. Используйте для экспериментов шестинедельных самок мышей CF1 весом 30–35 г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши содержались в группах (по 5 мышей в клетке) в индивидуально вентилируемых стерилизованных клетках с подстилкой из кукурузных початков 1/4" и квадратными гнездами 2" для гнездования. Клетки поддерживались в контролируемом 12-часовом цикле свет-темнота, а температура в помещении составляла от 19,4 °C до 25 °C. Мышей кормили глобальной диетой для грызунов и автоматической системой подачи воды.
2. Инструменты
   1. Используйте следующие хирургические инструменты для эффективного проведения операции: одноразовые шприцы (27 г, 1,0 мл) для внутрибрюшинного введения, машинка для стрижки меха, стереодиссекционный микроскоп, микрохирургические щипцы, микрохирургические ножницы, а также маленькие костные ронжеры и стерилизованные нетканые губки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты и материалы проходят автоклавную обработку перед операцией или предварительную стерилизацию производителями. Во время операции инструменты опрыскиваются 75% спиртом для поддержания стерильности.
3. Решения для анестезии
   1. Используйте раствор для анестезии #1 для введения анестезии и используйте раствор для анестезии #2 перед инъекцией ганглиев дорсального корешка (DRG) для поддержания анестезии.
      1. Для приготовления обезболивающего раствора #1 кетамин и ксилазин разводят в стерильном физрастворе до конечной концентрации 10 мг/мл и 1,2 мг/мл.
      2. Для приготовления обезболивающего раствора #2 разведите авертин в стерильном физрастворе до конечной концентрации 20 мг/мл.
4. DNA Plasmid and RNA Oligos
   1. Подготовьте плазмиды с использованием коммерческого набора, следуя протоколам производителя соответственно. Разбавляют плазмидные ДНК в стерильной деионизированной воде до концентрации 2,0 мкг/мкл.
   2. Добавьте раствор красителя Fast Green до достижения конечной концентрации 0,005–0,01% (v/v) для лучшей визуализации контура DRG во время инъекции.
   3. Растворите малые интерферирующие РНК (миРНК) или олигонуклеотиды микроРНК (олигонуклеотиды микроРНК) в соответствующих буферах, предоставленных производителями, до достижения конечной концентрации 50 мкМ.
5. Пипетка для микроинъекций
   1. Потяните за капиллярное стекло с помощью съемника микропипетки и отрежьте кончик вытянутой пипетки из капиллярного стекла ножницами для микрохирургии, чтобы создать отверстие с внешним диаметром примерно 50 мкм. Затем простерилизуйте стеклянную пипетку под ультрафиолетовым светом на чистом столе в течение примерно 20–30 минут.
   2. Установите стерилизованную стеклянную пипетку на держатель пипетки, подключенный к системе внутриклеточного дозирования микроинъекций. Установите параметры системы микровпрыска при давлении 30 фунтов на квадратный дюйм и длительности 8 мс.
6. Electroporation System
   1. Подключите электроды к системе электропорации прямоугольной фазы и установите следующие параметры: импульсы 15 мс при напряжении 35 В с интервалом 950 мс для электропорации in vivo.
7. Perfusion and Fixing Solution
   1. Растворите порошок параформальдегида (PFA) в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 4% (w/v). Храните раствор PFA при температуре 4 °C.

2. Экспериментальные процедуры

1. Хирургическое воздействие на L4 и L5 DRGs
   1. Обезболите мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции анестетика #1, приготовленного ранее (с кетамином 100 мг/кг массы тела и ксилазином 12 мг/кг массы тела).
   2. Побрейте операционную область машинкой для стрижки меха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку предстоит еще одна операция по поводу раздавливания левого седалищного нерва, шерсть левого заднего бедра можно сбривать одновременно.
   3. Поместите мышь на одеяло с подогревом (35,0 °C) и контролируйте температуру прямой кишки с помощью датчика температуры.
   4. Чтобы проверить анестезию, ущипните пальцы ног и хвост мыши и понаблюдайте за поведенческими реакциями.
   5. Прикрепите четыре конечности мыши к пробковой доске.
   6. Протрите область операции раствором йодофора, а затем используйте 75% спирт для удаления йодофора перед разрезанием кожи.
   7. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время пребывания под анестезией.
   8. Перед разрезом отметьте обе стороны гребней подвздошной кости тонким маркером. Проведите линию, соединяющую две точки гребней подвздошной кости, чтобы облегчить определение позиций ДРГ L5.
   9. Сделайте микроножницами разрез 3 см по средней линии поясницы. Кроме того, отделите параостистые мышцы, такие как многораздельная мускулатура и длинная поясничная мышца, от остистых отростков L3 до S1 и обнажите фасеточные суставы L4-5 и L5-6.
   10. Используйте микро-ронжер для удаления фасеточных соединений L4-5 и L5-6. Кроме того, удалите левую нервную дугу L4 и L5, чтобы обнажить дорсальную сторону DRG.
2. DRG Injection
   1. Введите раствор анестетика #2 (с авертином 200 мг/кг массы тела) внутрибрюшинно, чтобы сохранить анестезию перед инъекцией DRG.
   2. Загрузите плазмиды ДНК или олигон РНК (1 мкл на DRG) в стеклянную капиллярную пипетку.
   3. Осторожно вставьте кончик пипетки из капиллярного стекла в DRG.
   4. Постепенно вводите 1,0 мкл раствора ДНК-плазмид или РНК-олигонотид в DRG с помощью внутриклеточных систем дозирования микроинъекций (30 psi, 8 мс).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность инъекции должна длиться не менее 5 минут.
3. Electroporation
   1. Капните PBS на кончики электродов.
   2. Очистите кровотечение стерилизованной квадратной ватной марлей.
   3. Аккуратно зажмите целевую ДРГ электродами и подайте 5 квадратных электрических импульсов с помощью системы электропорации.
   4. Закройте мышечный и кожный слои соответственно нейлоновыми швами 5-0
   .
   5. Положите мышь на одеяло с подогревом (35,0 °C) под пристальным вниманием, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Верните мышь в домашнюю клетку после того, как она полностью оправится от анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши требуется примерно 60 минут, чтобы полностью восстановиться после анестезии на одеяле при температуре 37 °C. Растворите одну таблетку (200 мг) ибупрофена в 1000 мл воды (0,2 мг/мл) для ежедневного кормления, чтобы облегчить послеоперационную боль.
4. Sciatic Nerve Crush
   1. Через два или три дня (в зависимости от экспериментального плана) после электропорации DRG обезболите мышь внутрибрюшинным раствором анестетика #2 (с авертином 400 мг/кг массы тела).
   2. Прикрепите четыре конечности мыши к пробковой доске.
   3. Сделайте надрез на 1 см в 0,5 см в левую сторону по средней линии. Разрежьте мышцы, такие как большая ягодичная мышца и грушевидная мышца, в продольном направлении. Обнажите сегмент седалищного нерва между большим седалищным отверстием и седалищной выемкой.
   4. Раздавите нерв микрохирургическими щипцами в течение 12 с и отметьте место раздавливания нейлоновым эпиневральным швом 10-0. Сделайте узел на дюральной мембране, чтобы отметить место раздавливания.
   5. Закройте мышечные и кожные слои нейлоновым швом 5-0
   .
   6. Поместите мышь на подогретое одеяло (35,0 °C) с пристальным вниманием, пока она полностью не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Верните мышь в домашнюю клетку после того, как она полностью оправится от анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши требуется примерно 60 минут, чтобы полностью восстановиться после анестезии на одеяле при температуре 37 °C. Растворите одну таблетку (200 мг) ибупрофена в 1000 мл воды (0,2 мг/мл) для ежедневного кормления, чтобы облегчить послеоперационную боль.
5. Мышиная перфузия, DRG и сбор седалищного нерва<ol style='list-style-type:decimal;'>
6. Через два или три дня после сдавливания седалищного нерва (в зависимости от плана эксперимента) обезболите мышь внутрибрюшинным раствором анестетика #2.
7. Перфузируйте мышь транскардиально с помощью PBS (pH 7,4) с последующим замораживанием 4% параформальдегида (PFA) (pH 7,5) в PBS.
8. После перфузии отделите ДРГ вместе с нервными корешками и седалищным нервом до колена осторожно с помощью микроножниц и микрощипцов под микроскопом для вскрытия. Поместите седалищный нерв непосредственно в 4% PFA на ночь при температуре 4 °C.

Imaging and Measurement the Fluorescence-Labeled Sensory Axons

1. Аккуратно снимите прикрепленную ткань и мембрану на неподвижном седалищном нерве с помощью микроножниц и микрощипцов под микроскопом для вскрытия. Затем обменяйте 4% PFA на PBS и промойте нерв три раза.
2. Поместите седалищный нерв на предметное стекло и держите его прямо. Добавьте 80 μL раствора против выцветания вокруг нерва, затем наложите на него покровный лист. Расплющите всю смонтированную ткань с нажимом.
3. Поместите сплющенные ткани на инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный аксессуаром для получения мозаики и обработки изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длины возбуждения и излучения составляют 488 нм и 509 нм. Также можно вручную взять несколько перекрывающихся изображений и сшить изображения вместе с помощью ImageJ с плагином Mosaic.
4. При измерении длины регенерированных аксонов проследите все идентифицируемые флуоресцентно меченые аксоны в седалищном нерве от места раздавливания (отмеченного эпиневральным швом 10-0) до дистальных концов аксонов.

Материалы