Стереотаксическая трансплантация суспензии нервных клеток мышам с черепно-мозговой травмой

Аннотация

Источник: Furmanski, O., et al. Модель контролируемого кортикального воздействия повреждения головного мозга у мышей с терапевтической трансплантацией нервных клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео индуцированные человеком плюрипотентные нервные клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, стереотаксически вводятся на границе серого вещества и белого вещества глубокой коры головного мозга на мышиной модели черепно-мозговой травмы. Трансплантированные клетки интегрируются в ткань, способствуя функциональному восстановлению и репарации цепей в поврежденном мозге.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Стереотаксическая трансплантация клеточной суспензии

1. Начните процедуру трансплантации клеток примерно через 24 ч после краниэктомии.
2. Подготовьте оборудование для трансплантации клеток и хирургические принадлежности
   1. Наполните шприц объемом 1 мл стерильным физиологическим раствором для промывания раны. Прикрепите к шприцу иглу 25 G для контроля орошения.
   2. Наполните шприц со скользящим наконечником объемом 1 мл раствором CsA (циклоспорина А) для иммуносупрессии. Прикрепите к шприцу CsA иглу 25 G или больше. При необходимости пополняйте шприц CsA между операциями.
   3. Подготовьте стеклянные иглы из капиллярных пипеток из боросиликатного стекла с наружным диаметром 1,0 мм стандартными методами.
   4. С помощью тонкого пинцета сломайте кончики игл примерно до диаметра 200 мкм. Следите за тем, чтобы цилиндрический стержень иглы был не длиннее 2,5 см.
3. Откалибруйте шприцевой насос для использования со шприцем объемом 10 мкл. Введите расход 0,2 μл/мин, чтобы получить общий объем 2,0 μл.
4. Приготовьте суспензию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК).
   1. Выполните все операции с клетками в капюшоне BSL-2 (уровень биобезопасности 2) с использованием стандартных методов стерильного обращения.
   2. Заранее подготовьте клеточные культуры в соответствии со стандартными условиями, определенными для типа клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах, показанных в этой демонстрации, использовались различные нейронные фенотипические клетки, полученные из hiPSCs.
   3. Аккуратно диссоциируйте клетки в одноклеточную суспензию с помощью раствора для отслойки клеток или других предпочтительных ферментативных или химических средств.
   4. Подсчитайте клетки в суспензии, затем разбавьте суспензию до 5 x 10⁴ клеток/мкл в минимальной среде для культивирования клеток (например, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)) в пробирке с откидной крышкой.
   5. Соблюдайте следующие примечания по трансплантации:
      1. Поддерживайте клетки во взвешенном состоянии при температуре 37 °C в течение всего периода процедуры.
      2. Загружайте шприц только непосредственно перед выполнением внутрипаренхиматозной инъекции
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточная суспензия лежит на боку, сила тяжести может привести к ее оседанию или цеплянию за стенку шприца, что приведет к нарушениям в количестве вводимых клеток.
      3. Выделите ~5 x 10⁵ клеток (суспензия 10 мкл) на мышь при выполнении нескольких процедур трансплантации клеток в один день.
5. Выполните стереотаксическую операцию по трансплантации
   1. Поместите мышь в камеру индукции анестезии, подключенную к изофлурановому испарителю с источником сжатого кислорода. Индуцируйте анестезию ~3% изофлураном при концентрации кислорода ~0,7 л/мин.
   2. Поместите мышь в стереотаксическую рамку с прикрепленным анестезирующим конусом для носа.
      1. Закрепите голову на месте с помощью ушных планок и планки для укуса, ориентируя голову так, чтобы лобная кость черепа была горизонтальной. Поддерживайте анестезию на уровне 1,5%-2% изофлурана в течение всей операции.
   3. Проведите предоперационный уход и асептическую подготовку
      1. Нанесите увлажняющую офтальмологическую мазь, содержащую антибиотики, на глаза с помощью ватного тампона.
      2. Промывайте место разреза стерильным физиологическим раствором, чтобы очистить место и ослабить швы. Аккуратно нанесите 70% этанол ватным тампоном, чтобы простерилизовать место разреза.
   4. Снимите швы с помощью тонкого пинцета и офтальмологических ножниц. Ирригация места операции и краниэктомии обильным применением стерильного физиологического раствора.
      1. Если кора демонстрирует дисквалифицирующие характеристики, такие как чрезмерная грыжа, обесцвечивание, нарушенная васкуляризация или кровоизлияние, животное должно быть исключено.
   5. Загрузите шприц для трансплантации клеток
      1. Переместите клеточную суспензию из инкубатора с температурой 37 °C в колпак биобезопасности для клеточных культур. Аккуратно покрутите или постучите по пробирке, чтобы получить однородную клеточную суспензию.
      2. С помощью микродозатора загрузите суспензию клеток ~7,5 мкл в шприц Hamilton через конец поршня.
         1. Держите шприц под углом ~120° концом поршня вниз. Вставьте поршень, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха между подвеской и наконечником плунжера.
      3. Прикрепите узел прокладки к игле пипетки, затем прикрепите иглу к шприцу.
      4. Нажмите на поршень, чтобы переместить клеточную суспензию в иглу пипетки. Если есть сопротивление вытеканию суспензии, используйте тонкий пинцет, чтобы сломать кончик иглы, чтобы увеличить диаметр.
   6. Присоедините шприц к стереотаксическому шприцевому насосу. Переместите поршень, чтобы убедиться, что шприцевой насос в сборе работает правильно.
   7. Переместите иглу в координаты для инъекции.
      1. Выровняйте кончик иглы по брегме. Установите координаты X и Y равными 0. Затем переместите кончик иглы над местом краниэктомии на 2,0 мм латерально и на -1,0 мм кзади от брегмы. Прикоснитесь кончиком иглы к поверхности твердой мозговой оболочки и установите стереотаксическую координату на Z = 0.
      2. Нажмите на поршень, чтобы убедиться, что клеточная суспензия течет достаточно, прежде чем вводить иглу в мозг.
      3. Ввести иглу в мозг на глубину Z=-1,4 мм. Эти стереотаксические координаты помещают трансплантат на границе серого вещества и белого вещества глубокой коры.
   8. Запустите шприцевой насос для введения клеточной суспензии. Установите таймер лабораторного стола на 15 минут и запустите таймер. Используйте микроскоп с большим рабочим расстоянием для контроля оттока клеточной суспензии.
      1. Орошайте место операции стерильным физиологическим раствором во время инъекции для поддержания увлажнения тканей.
      2. Через 15 минут медленно извлеките иглу для трансплантации. Орошите место операции физиологическим раствором и закройте разрез швами.
   9. Выполните послеоперационный уход
      1. Прекратите анестезию. Введение CsA путем подкожного введения в загривок в дозе 10 мг/кг. Поместите мышь в чистую и предварительно прогретую послеоперационную клетку.
      2. Обеспечьте анальгетик ацетаминофеном в питьевой воде в концентрации 1,0 мг/мл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте анальгезию в соответствии со стандартным операционным протоколом (СОП) Комитета по уходу за институциональными животными и их использованию (IACUC) и с учетом переменных результатов эксперимента.
      3. Предусмотрите увлажненную клетку для восстановления корма для чау-чау, чтобы помочь регидратации и восстановлению.
6. Продолжайте ежедневные инъекции CsA в дозе 10 мг/кг в течение всего периода выживания мыши.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл шприцы	Becton Dickinson (BD)	309659
1,7 мл откидные пробирки	Denville	C2170
10 микролитров шприц	Hamilton	7635-01
25G Иглы для шприцев Precision Glide	Becton Dickinson (BD)	305122
70% этанол			Продукт выбора; варьируется в зависимости от региона
Пероральная суспензия ацетаминофена	Тайленол (детский)		Разведите до 1 мг/мл в воде
Анестетический испаритель	Vetland	0521-11-22
Салфетка		для работы с животными	Покупка в универмаге
Betadine	Purdue Products	NDC-67618-151-32
Сжатый кислород			Продукт на выбор; варьируется в зависимости от региона
Циклоспорин А	Sigma-Aldrich	30024-100 мг
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
Изолента	3M Corporation		Купить в универмаге
Тонкий пинцет	Fine Science Tools	11254-20
Щипцы	Fine Science Tools	91106-12
Стеклянные капиллярные пипетки, 1 мм OD, 0,58 мм ID	World Precision Instruments	1B100F-3
Комплект высокоскоростных роторных микромоторов	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
Ideal Micro Drill Набор из 5	точек ячеек Scientific	60-1000
Impact One Stereotaxic Impactor для CCI	Leica Biosystems	39463920
изофлурана	Baxter	NDC-10019-360-60
Лабораторный настольный таймер	Fisher Scientific	14-649-17
Микропипетка пуллер	MicroData Instruments, Inc.	ПМП-102	Любой съемник будет достаточным
Чехолки для микроскопа	Фишербранд	12-545-Е Средство
		для крепления предметного стекла Микроскоп	Продукт выбор
Зеркало Купить			в универмаге
Иглодержатель гемостат	Fine Science Tools	12002-12
Офтальмологический мазь	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
Ножницы офтальмологические пружинные Fine	Science Tools	15018-10
Пластиковая коробка			Купить в универмаге
Пластиковый цилиндр			Купить в универмаге
QSI моторизованный шприцевой насос	Stoelting	53311
Съемный игольчатый компрессионный фитинг	Hamilton	55750-01
Маленькая рамка для грызунов	Stoelting	51925
Маленькие ножницы	Fine Science Tools	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
Стерильные спиртовые салфетки для приготовления	Fisherbrand	06-669-62
Стерильные ватные палочки/ватные палочки Kendall Q-tips	Tyco Healthcare	540500
Стерильный физиологический раствор	Hospira	NDC-0409-1966-07
Секундомеры (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Superfrost Plus Gold микроскопические слайды	Fisherbrand	15-188-48
Шовные материалы - 5.0 шелк с изогнутой иглой	Оазис	МВ-682