Лентивирусная трансдукция нейральных клеток-предшественников для эпигенетической регуляции экспрессии альфа-синуклеина

Аннотация

Источник: Tagliafierro, L., et al. Платформа лентивирусного вектора для эффективной доставки инструментов редактирования эпигенома в модели заболеваний, индуцированных плюрипотентными стволовыми клетками человека. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется лентивирусная трансдукция нейронных клеток-предшественников (NPC) для целевой эпигенетической модификации альфа-синуклеина, ключевого белка при болезни Паркинсона. Протокол обеспечивает метилтрансфераза-опосредованное метилирование ДНК, снижая экспрессию SNCA для изучения регуляции генов и потенциальных терапевтических вмешательств.

Протокол

1. Дифференцировка дофаминергических нейральных клеток-предшественников

1. Размораживание MD NPC (дофаминергические нейронные клетки-предшественники среднего мозга)
   1. Подготовьте пластину с покрытием BMM (базовая матричная мембрана) и нагрейте весь N2B27. Добавьте 10 мл теплого DMEM/F12 в коническую пробирку объемом 15 мл. Поместите криовиал в термоблок при температуре 37 °C на 2 мин.
      1. Перенесите клетки из криовиала в пробирку, содержащую DMEM/F12. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин.
      2. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки в 2 мл N2B27 и добавьте клеточную суспензию в одну лунку пластины, покрытой BMM. Инкубируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2.

2. Трансдукция MD NPC и анализ изменений метилирования

1. Transduction of MD NPCs
   1. Transduce MD NPC при 70% слиянии с LV (лентивирусный вектор)-guide RNA/деактивированными векторами Cas9-DNMT3A (фермент метилтрансферазы ДНК 3A) при MOI (множественность инфекции) = 2. Замените средний N2B27 через 16 часов после трансдукции.
   2. Добавьте N2B27 с 5 мкг/мл пуромицина, через 48 ч после трансдукции. Культивируйте клетки в течение 3 недель в N2B27 плюс пуромицин для получения стабильных линий MD NPC. Клетки готовы к последующему применению (анализы ДНК, РНК, белков, фенотипическая характеристика, замораживание и пассаж).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Оборудование
15 мл конические центрифужные пробирки	Corning	430791
6-луночные планшеты	Corning	3516
Allegra 25R настольная центрифуга	Beckman Coulter	369434
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Leica	DM IRB2
Реагенты
Антибиотик-антимикотический раствор, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 Добавка (50X), минус витамин А	Thermo Fisher Scientific	12587010
Corning Matrigel с квалификацией hESC-Matrix	Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049

для клеточных культур