Внутриутробная вирусная трансдукция у мышей

Аннотация

Источник: Lutz, D., et al. Оценка параметров ультраструктурной нейропластичности после внутриутробной трансдукции развивающегося головного и спинного мозга мыши. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется вирусная трансдукция эмбрионов мышей с помощью внутриутробной инъекции. Беременную мышь готовят к операции, и делают разрез по средней линии, чтобы обнажить рога матки. Смесь вируса, содержащего нужный ген, и отслеживающего красителя вводится в эмбрионы в маточных мешочках в целевых местах. Затем маточные рога помещаются обратно перед наложением швов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Внутриутробная трансдукция

1. Приготовьте аденоассоциированный вирус типа 1 (AAV1), кодирующий желаемую мишень (4 x^{10 11} вирусных частиц/мкл AAV1) в фосфатно-солевом буфере (PBS) при pH 7,4. Добавьте 0,1 мг/мкл Fast Green и поддерживайте смесь AAV1-Fast-Green при температуре 37 °C.
2. Подготовьте тонкий капиллярный наконечник нужной формы (длина 8 мм, внешний диаметр 80 мкм и внутренний диаметр 50 мкм) с помощью съемника микропипеток (настройки: давление = 500, нагрев = 700, вытягивание = 0, скорость = 80, время = 200, см. Таблицу материалов). Разломайте кончик капилляра так, чтобы он составлял 4-5 мм.
3. Соберите аспираторную трубку (44 см x 0,7 см) с капиллярным наконечником и отасуньте в капилляр 15 мкл смеси AAV1-Fast-Green.
4. Поддерживайте постоянную физиологическую температуру тела животных на уровне 37 °C на протяжении всей процедуры.
5. Поместите беременную мышь C57Bl/6 (эмбриональный день 14,5) в прединкубационную камеру и обезболите мышь газообразным 4% изофлураном (с объемным расходом воздуха 0,6-0,8 л/мин).
6. Подкожно вводят бупренорфин (0,1 мг/кг массы тела).
7. Поместите мышь под наркозом на предварительно подогретую хирургическую пластину (37 °C).
8. Нанесите на глаза лубрикант.
9. Наденьте мышь на анестезиологическую маску (газообразный 1,5 % изофлуран с объемным расходом воздуха 0,6-0,8 л/мин) на операционную пластину и побрейте область кожи живота. Протрите выбритую область 3X 75% этанолом, а затем раствором бетадином.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Постоянно следите за дыханием мыши, находящейся под наркозом. Отрегулируйте концентрацию газа изофлуран в соответствии с характером вдоха-выдоха мыши.
10. Проверьте отсутствие подошвенного рефлекса, сдавливая фаланги задней лапы мыши.
11. Вскрыть брюшную полость, захватив кожу изогнутыми зубчатыми щипцами радужной оболочки (10 см) и разрезав кожу по медианной линии прямыми ножницами из карбида вольфрама (10 см), а затем, захватив стенку брюшины прямым пинцетом Дюмонта (12 см, 0,2 мм х 0,12 мм) и разрезав стенку вдоль белой линии прямыми ножницами Ванны (8 см).
12. Поместите кусочек фенестрированной парафиновой пленки на брюшное отверстие и зафиксируйте пленку с обоих концов микромоскитными кровоостанавливающими щипцами (12,5 см, изогнутыми).
13. Обнажите рога матки с помощью ложечкообразного приспособления, чтобы избежать повреждения эмбрионов внутри маточных рогов. Капните несколько капель PBS (37 °C) на рога матки и осмотрите эмбрионы на предмет повреждений или пороков развития внутри маточного мешка.
14. Задокументируйте порядок и положение эмбрионов в рогах матки. Осторожно переверните эмбрионы внутрь маточного мешка до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое положение для инъекции.
15. Введите 1-2 мкл смеси AAV1-Fast-Green, визуально осмотрев место инъекции (например, желудочки мозга) и проникновение красителя под стереомикроскопом.
16. Задокументируйте введенные эмбрионы и поместите рога матки с введенными эмбрионами обратно в брюшную полость.
17. Капните несколько капель PBS (37 °C) в брюшную полость. Закройте полость, зашив стенку брюшины (используйте полиамидные шовные материалы размера 6-0) и кожу (используйте полиамидные шовные материалы размера 3-0) с помощью москитных кровоостанавливающих щипцов Холстеда (12,5 см, изогнутые). В качестве альтернативы используйте простой прерывистый узор или шов/скобки из нержавеющей стали, чтобы закрыть брюшную полость и кожу.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
26Gx 1'' игла	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Анестезиологическая установка для воздушного насоса	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
Аденоассоциированный вирус серотипа 1 (AAV1)	УКЭ (вирусный Core Facility)	-	Ссылки и целевые области AAV1 см.: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/, а также: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Квон И, Шаффер Д.В. Pharm Res. 2008 март; 25(3):489-99. Рекомбинантные вирусные векторы AAV, псевдотипированные вирусными капсидами из серотипов 1, 2 и 5, демонстрируют дифференциальную эффективность и клеточный тропизм после доставки в различные отделы центральной нервной системы. Бургер С., Горбатюк О.С., Велардо М.Дж., Педен С.С., Уильямс., Золотухин С., Рейер.Дж., Мандель Р.Дж., Музычка Н. Мол. 2004 Август; 10(2):302-17. Векторы самокомплементарного рекомбинантного аденоассоциированного вируса (scAAV) способствуют эффективной трансдукции независимо от синтеза ДНК. Маккарти Д.М., Монахан.Е., Самульски Р.Дж. Джин Тер. 2001 август; 8(16):1248-54.
Воздушный насос	Биомедицинские инструменты (Univentor)	Аспиратор Eheim 100
Аспиратор в сборе	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Дыхательная маска Мышь Анодированный алюминий	Биомедицинские инструменты (Univentor) -
бупренорфин	темгезик	ампулы	обезболивающие
капилляры	Наука-Продукты	GB100TF-10	с
пинцетом Dumont (#3, 12 см, прямой, 0,2 x 0,12 мм)	FST	11203-23
Электробритва	Phillips	-
материалы (Ethilon, 6-0 и 3-0)
смазка для глаз	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	для визуализации вводимых жидкостей
Gas Routing Switch 4/2 разъема	Biomedical Instruments (Univentor)	8433020
Halsted Mosquito гемостатические щипцы (12,5 см, прямые)	FST	13011-12
Индукционный бокс для мышей с горизонтально движущейся крышкой. Внутренние размеры: ДхВхВ: 155x115x130 мм. Толщина стенки: 6 мм	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Щипцы для радужной оболочки глаза (10 см, изогнутые, зубчатые)	FST	14007-14
Ножницы для ириса (11 см, прямые, карбид вольфрама)	FST	14501-14
Изофлуран OP Tisch, с электрическим подогревом, смВнешние размеры: 257x110x18 мм. Площадь нагрева: 190x90 ммУдаление изофлурана, выходящего из дыхательной маски, осуществляется вниз в соответствии с правилами	Биомедицинские инструменты (Univentor)	-
Изофлуран (Аттан)	JD медицинская		ингаляционная анестезия
Световой микроскоп Basic DM E	Leica-4x		(N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) объективы
Micropipette pulle	Science-Products	P-97
Mosquito кровоостанавливающие щипцы (12.5см, изогнутые)	FST	13010-12
Термопуллер P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 Материал трубки для соединения всех частейВнешний диаметр: 6ммВнутренний диаметр: 4ммТолщина стенки: 1мм	Биомедицинские инструменты (Univentor)
Ножницы Vannas (8 см, прямые)	FST	15009-08

Ethicon шовные Ethicon-полиамидная