Стереотаксическое введение гидрогеля в модель мыши после инсульта

Аннотация

Источник: Wilson, K.L., et al. Инъекция каркасов гидрогелевого биоматериала в мозг после инсульта. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео демонстрируется стереотаксическое введение гидрогеля в инсультное ядро мыши после инсульта, подчеркивая его роль в формировании каркаса, который имитирует внеклеточный матрикс, способствует клеточной инфильтрации и поддерживает ангиогенез, подчеркивая его нейротерапевтический потенциал в восстановлении после инсульта.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

Инъекция гидрогеля или других биоматериалов

1. Выполните инъекцию биоматериалов в заданное пользователем время. В этом эксперименте инъекции были выполнены между 5 и 7 днями после инсульта. Вводится 2 - 6 мкл гидрогеля.
   1. Включите грелку, чтобы поддерживать температуру тела мыши во время анестезии (37 °C).
   2. Приготовьте автоклавные ножницы, щипцы, вату, ветеринарную глазную мазь, хирургический клей или шовный материал, стерильный спирт и салфетки с бета-йодом. Подготовьте сверло для кости с помощью стерильных головок сверл и стеклянных шприцев Hamilton объемом 25 мкл с металлическими иглами 30 G.
   3. Включите стерилизацию шариков до 160 °C, чтобы обеспечить стерилизацию инструментов между мышами.
   4. Подсоедините инжекторные насосы к стереотаксическому устройству. Установите скорость потока на 1 μл/мин и установите объем на 4 μл.
   5. Подготовьте чистую клетку для мышей после операции.
2. Поместите мышь в индукционную камеру с концентрацией изофлурана 4% для обезболивания до тех пор, пока спонтанное движение не прекратится и ее дыхание не станет медленным, устойчивым.
   1. После перехода в спящий режим перенесите и закрепите мышь на стереотаксическом устройстве с поддерживающей концентрацией изофлурана 1,5%.
   2. Нанесите ветеринарную глазную мазь на оба глаза.
   3. Сбрейте шерсть, которая могла отрасти с головы мыши, и асептически подготовьте область, используя спиртовую салфетку, а затем салфетку с бета-йодом. Повторите три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте дополнительную спиртовую салфетку в конце, чтобы удалить весь бета-йод, так как он вызывает раздражение кожи и вызывает у мышей зуд черепа после операции.
3. С помощью маленьких ножниц и/или щипцов снова откройте кожу над мозгом. Используйте вату со стерильным физиологическим раствором или PBS (фосфатно-солевой буфер) для очистки черепа от мусора. Будет виден бело-желтый круг (ход, рис. 1B) и отверстие от бура. Если омертвевшая ткань не видна, скорее всего, инсульт не произошел. Если отверстие для заусенцев не находится по центру над ходом, повторно просверлите, чтобы отцентрировать его.
4. Направьте инжекторный насос на мышь и зафиксируйте его под углом 90°. Очистите шприц стерильным физиологическим раствором или раствором PBS перед тем, как загрузить материал.
   1. После очистки разберите стеклянный шприц так, чтобы там не было иглы. Загрузите шприц с помощью пипетки положительного вытеснения объемом 25 мкл с 10 мкл гидрогеля (или другого биоматериала с клетками или без них).
   2. С помощью поршня шприца протолкните гель до упора на переднюю часть шприца. Затем соберите шприц и продолжайте надавливать, пока гель заметно не начнет выделяться из иглы.
5. Наденьте шприц на помпу. Возможно, потребуется отрегулировать заднюю часть помпы так, чтобы шприц подходил по размеру. Отрегулируйте расход до 30 μл/мин, выберите Забор или Впрыск в зависимости от направления движения, а затем нажмите Старт. Нажмите кнопку «Стоп», когда задняя часть насоса окажется в правильном месте.
   1. Прикрутите заднюю часть насоса, чтобы шприц был надежно закреплен. Если ранее были внесены корректировки, убедитесь, что скорость потока установлена обратно на 1 мкл/мин и настроена на впрыск.
6. Переместите насос в направлениях x и y, чтобы ориентировать его над отверстием. Перемещайте насос вниз по оси Z, пока игла шприца не коснется верхней части отверстия.
7. Сбросьте значение Z на консоли цифрового дисплея. Затем переместите шприц вниз в направлении z на 0,750 мм. Если шприц прогибается или есть сопротивление, череп либо зажил, либо не был полностью просверлен, и его нужно сверлить повторно.
8. Нажмите кнопку Start на консоли насоса, чтобы ввести 4–6 мкл гидрогеля со скоростью 1 мкл/мин.
9. Установите 5-минутный таймер, когда насос прекращает впрыскивание, чтобы гель начал сшивание.
10. Через 5 минут медленно подтяните шприц, поворачивая z-nob. Следите за тем, чтобы какой-либо материал случайно не вытянулся или не вытек из отверстия. Разблокируйте насос и отодвиньте его от мыши, когда игла будет достаточно далеко от черепа.
11. С помощью щипцов, хирургического клея или швов закройте кожу над головой. Поместите мышь в чистую клетку и наблюдайте за ее восстановлением. Мышь должна восстановиться после анестезии примерно через 5–10 минут.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение брегмы и локализация штриха. (А) Теменные доли сходятся на вершине, образуя брегму. Лазер был размещен по центру в 2,0 мм левее брегмы. (B) Визуальное подтверждение инсул...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
25uL Hamilton Syringe 702RN, без иглы	Fishcer Scientific	14824663	Шприцы, используемые для введения биоматериалов
25 мкл Пипетка положительного смещения	Gilson	M-25
Регулируемая сценическая платформа	Kopf Инструменты	901
C57BL/6 мышей	Jackson Laboratory	664	8-12 недель возраст
Сборка клетки Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Длинная, диаметр 6мм, 4 упаковки - для крепления лазера к стеротаксу
Ватные палочки	VWR	89031-288
CP 25 наконечники для пипеток	Gilson	F148012
Нагревательная пластина	Kopf Инструменты	HP-4M
IMPAC 6-интегрированный центр анестезии для нескольких пациентов	VetEquip	901808
Jewlers Щипцы #5	GFS химикаты	46085
Miltex Adson Перевязочные щипцы,	Intefra	V96-118
Мини-насос с переменным расходом	Thomas Scientific	70730-064	Насос для перфузии
мышь газовая анестезия держатель головки	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Control Box	Chemyx	10050
Nanojet коллектор насоса	Chemxy	10051	Прикрепить к стереотаксическому устройству для введения биоматериала
Игла RN 30G PT STY 3, 0,5 дюйма	Fishcer Scientific	NC9459562
Неразрывные ушные планки 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Ректальный зонд мыши	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 Инсулиновый шприц с маркировкой 1/2 единицы 0,5 мл	VWR	10002-726	Для инъекций розовой бенгалии
StainTray Slide Staining System	Simport Scientific	M920-2	Для окрашивания предметных стекол
Sterotaxic Device	Kopf Instruments	940	Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Щипцы -1x2 зуба	Fine Science Tools	91127-12
Студенческие тонкие щипцы - прямые/широкие хвостовики	Fine Science Tools	91113-10
Регулятор температуры	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Ткань-Тек Соединение ОКТ	VWR	25608-930
Vetbond Тканевая адгезивная 3 мл	Санта Круз Биотехнология	sc-361931