$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысам-донорам разрешен свободный доступ к пище и воде перед процедурами донорства кожи и мышц. Эвтаназия проводится под глубокой анестезией с последующим внутрисердечным введением хлорида калия с помощью вторичного метода двустороннего пневмоторакса. Любая линия крыс теоретически может быть использована в этом эксперименте; тем не менее, наша лаборатория достигла стабильных результатов как на самцах, так и на самках крыс Fischer F344 (~200-250 г) в возрасте от двух до четырех месяцев. Крысы-доноры должны быть изогенными по отношению к подопытным крысам.
1. Приготовление дермального трансплантата
- : Обезболить крысу-донора в индукционной камере с использованием раствора 5% изофлурана в кислороде со скоростью 0,8-1 л/мин. После того, как крыса будет обезболива, ее извлекут из индукционной камеры и положат на дышащий носовой конус, снижая изофлуран до 2-2,5% для поддержания анестезии.
- Вводят раствор 0,02-0,03 мл карпрофена (50 мг/мл) в 0,2 мл стерильного физиологического раствора подкожно между лопатками для обезболивания.
- Нанесите мазь искусственных слез на оба глаза, чтобы предотвратить язвы роговицы.
- С помощью машинки для стрижки выбрейте всю нижнюю заднюю конечность, область лодыжки и боковые стороны лап.
- Очистите выбранную заднюю конечность и подошвенную поверхность лапы спиртом, затем раствором йодоповидона, заканчивая заключительным очищением спиртом для удаления остатков йодоповидона.
- С помощью ручного микромоторного высокоскоростного сверла со съемным круглым мелким камнем для полировки (4000 об/мин) заусенцы подошвенной поверхности лапы для удаления эпидермиса. Во время заусенца наносите капельки солевого раствора, чтобы не обжечь кожу. Нижележащая дерма будет иметь блестящий вид с точечным кровотечением.
- Наложите жгут на нижнюю конечность, чтобы замедлить кровоток.
- Резко снимите подошвенную кожу скальпелем #15 и поместите ее в марлю, смоченную солевым раствором, чтобы предотвратить высыхание. Некоторые сухожильные и соединительные ткани будут удалены вместе с кожей на этом этапе и будут удалены позже.
- Наложите марлевую пленку на кровоточащую ногу, чтобы замедлить кровотечение. Повторите шаги 1.5-1.9, если делаете две конструкции.
- Под микроскопом (20-кратное увеличение) с помощью микроножниц удалите сухожилие и соединительную ткань из глубокого слоя кожного трансплантата. Следите за тем, чтобы в привое не проделались отверстия. Истонченный дермальный трансплантат должен быть слегка непрозрачным, содержать только дерму, размером примерно 0,5 см х 1,0 см.
- Поместите в марлю, смоченную солевым раствором, до готовности к изготовлению конструкции C-RPNI. Прививки следует использовать в течение 2 часов после забора.
2. Подготовка мышечного трансплантата
:
- Сделайте продольный разрез вдоль передней части нижней задней конечности от чуть выше лодыжки до чуть ниже колена с помощью скальпеля #15. Рассекайте подкожную клетчатку, чтобы обнажить подлежащую мускулатуру.
- На дистальной стороне разреза обнажите сухожильные вставки мускулатуры нижней конечности. Передняя большеберцовая кость (ТА), как правило, является самой большой и самой передней мышцей, и непосредственно под ней и позади этой мышцы находится длинный разгибатель пальца (EDL). Изолируйте дистальное сухожилие EDL от других сухожилий в этой области, стараясь не разрезать его вставку.
- Обеспечьте изоляцию правильного сухожилия, вставив оба зубца щипца под сухожилие и оказывая давление вверх, открывая щипцы для смещения сухожилия. Манипуляции с этим сухожилием должны привести к одновременному разгибанию всех пальцев ног.
- Выполните дистальную тенотомику острыми ножницами по радужной оболочке и отделите мышцу от окружающих тканей тупыми ножницами (или другими ножницами с тупым концом), работая проксимально, чтобы найти сухожильный источник.
- После того, как проксимальный отдел сухожилия будет визуализирован, снова выполните тенотомию острыми ножницами радужной оболочки. Поместите мышечный трансплантат в марлю, смоченную солевым раствором, чтобы предотвратить высыхание.
- После того, как все желаемые трансплантаты были удалены у донорской крысы, усыпляют сначала путем внутрисердечной инъекции KCl (1-2 mEq K+/кг) с последующей вторичной эвтаназией с помощью двустороннего пункционного пневмоторакса с помощью лезвия #15.
3. Общая изоляция малоберцового нерва и препарат
- Обезболить и обеспечить обезболивание подопытной крысы в соответствии с протоколом, изложенным в пунктах 1.1-1.3.
- Побрейте нужное бедро и очистите его спиртом, бетадином, а в конце – спиртом, чтобы удалить следы бетадина.
- Переместите животное со стола для подготовки к хирургическому микроскопу и положите его на грелку с датчиком температуры для поддержания температуры тела. Поддерживайте изофлуран в концентрации 2-2,5% и кислород в дозе 0,8-1 л/мин.
- Отметьте разрез, простирающийся от дистального отдела до седалищной выемки до нижней части колена. Эта маркировка должна быть ниже бедренной кости и находиться под углом от нее. Сделайте надрез лезвием #15, разрезая нижележащую фасцию бицепса бедра.
- Осторожно рассеките двуглавую мышцу бедра с помощью гемостата или микроножниц с тупым концом до пространства, лежащего под двуглавой мышцей бедра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Седалищный нерв проходит примерно в том же направлении, что и первоначальный разрез, который был сделан. Существует три ветви, обычно с задней частью икроножного нерва и общим малоберцовым и большеберцовым нервами, проходящими поверхностно и глубоко к колену соответственно. - После идентификации общего малоберцового нерва (ДЦП) с помощью пары микрощипцов с тонким наконечником и микроножниц осторожно изолируйте нерв ЦП от других ветвей седалищного нерва и удалите любую оставшуюся соединительную ткань дистально.
- В точке, где нерв пересекает поверхность колена, резко пересеките нерв микроножницами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование острых ножниц чрезвычайно важно на этом этапе, так как нанесение значительной травмы нерва может увеличить риск образования невриномы. - Осторожно освободите оставшуюся соединительную ткань от нерва ЦП и работайте проксимально, чтобы освободить нерв на длину примерно 2 см.
4. Изготовление конструкции C-RPNI
:
- Извлеките мышечный трансплантат из марли, смоченной солевым раствором, и удалите всю центральную сухожильную ткань, а также небольшой центральный сегмент эпимизии. Оставьте сухожильные концы нетронутыми.
- Использование 8-0 Нейлоновый шов, закрепить эпиневрий перерезанного конца нерва ЦП в области мышечного трансплантата, лишенного эпимизиума, двумя прерывистыми швами с каждой стороны нерва.
- Закрепите мышечный трансплантат на надкостнице бедренной кости одним прерывистым стежком из нейлона 6-0 как проксимально, так и дистально, при этом нервно-мышечное соединение должно быть обращено в сторону от бедренной кости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Закрепите мышцу так, чтобы она находилась на нормальной, расслабленной длине. Старайтесь не растягивать мышцу значительно и не оставлять слишком много дряблости при закреплении. - Ставка 8-0 Нейлоновый шов на нижнем, центральном крае эпимизиума мышечного трансплантата, прикрепляя его к эпиневрию нерва ЦП таким образом, чтобы создать дряблость нерва внутри мышечного трансплантата и помочь снять любое напряжение в будущем, которому он может подвергнуться при последующей ходьбе.
- Извлеките кожный трансплантат из увлажненной солевым раствором марли и расположите его на мышечном трансплантате таким образом, чтобы полностью покрыть нерв и большую часть мышцы. Убедитесь, что глубокий край дермы упирается в мышцу. Обрежьте любую дерму, которая выходит за границу мышцы.
- Закрепите кожный трансплантат на мышечном трансплантате по окружности с помощью 8-0 Нейлоновые прерывистые швы. Как правило, используется 4-8 швов в зависимости от размера конструкции.
- Закройте фасцию бицепса бедра над конструкцией в беговой манере хромическим швом 5-0.
- Закройте вышележащую кожу хромированным швом 4-0 по беговой схеме.
- Промокните операционную область спиртовой салфеткой и нанесите мазь с антибиотиком.
- Прекратите ингаляционный анестетик и дайте крысе восстановиться с помощью источников пищи и воды, отделенных от соседей по клетке.