Построение композитного регенеративного интерфейса периферических нервов на модели повреждения нерва у крысы

Аннотация

Источник: Svientek, S. R., et al. Изготовление композитного регенеративного периферического нервного интерфейса (C-RPNI) у взрослой крысы. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется хирургическое построение композитного регенеративного периферического нервного интерфейса (C-RPNI) на модели повреждения периферических нервов на крысе. Процедура включает в себя прикрепление перерезанного малоберцового нерва к мышечному трансплантату и наложение на него дермального кожного трансплантата для содействия регенерации нервов. Со временем моторные и сенсорные нейроны восстанавливают связи внутри трансплантатов, что позволяет формировать функциональные нервно-мышечные и сенсорные структуры.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

ПРИМЕЧАНИЕ: Крысам-донорам разрешен свободный доступ к пище и воде перед процедурами донорства кожи и мышц. Эвтаназия проводится под глубокой анестезией с последующим внутрисердечным введением хлорида калия с помощью вторичного метода двустороннего пневмоторакса. Любая линия крыс теоретически может быть использована в этом эксперименте; тем не менее, наша лаборатория достигла стабильных результатов как на самцах, так и на самках крыс Fischer F344 (~200-250 г) в возрасте от двух до четырех месяцев. Крысы-доноры должны быть изогенными по отношению к подопытным крысам.

1. Приготовление дермального трансплантата

1. : Обезболить крысу-донора в индукционной камере с использованием раствора 5% изофлурана в кислороде со скоростью 0,8-1 л/мин. После того, как крыса будет обезболива, ее извлекут из индукционной камеры и положат на дышащий носовой конус, снижая изофлуран до 2-2,5% для поддержания анестезии.
2. Вводят раствор 0,02-0,03 мл карпрофена (50 мг/мл) в 0,2 мл стерильного физиологического раствора подкожно между лопатками для обезболивания.
3. Нанесите мазь искусственных слез на оба глаза, чтобы предотвратить язвы роговицы.
4. С помощью машинки для стрижки выбрейте всю нижнюю заднюю конечность, область лодыжки и боковые стороны лап.
5. Очистите выбранную заднюю конечность и подошвенную поверхность лапы спиртом, затем раствором йодоповидона, заканчивая заключительным очищением спиртом для удаления остатков йодоповидона.
6. С помощью ручного микромоторного высокоскоростного сверла со съемным круглым мелким камнем для полировки (4000 об/мин) заусенцы подошвенной поверхности лапы для удаления эпидермиса. Во время заусенца наносите капельки солевого раствора, чтобы не обжечь кожу. Нижележащая дерма будет иметь блестящий вид с точечным кровотечением.
7. Наложите жгут на нижнюю конечность, чтобы замедлить кровоток.
8. Резко снимите подошвенную кожу скальпелем #15 и поместите ее в марлю, смоченную солевым раствором, чтобы предотвратить высыхание. Некоторые сухожильные и соединительные ткани будут удалены вместе с кожей на этом этапе и будут удалены позже.
9. Наложите марлевую пленку на кровоточащую ногу, чтобы замедлить кровотечение. Повторите шаги 1.5-1.9, если делаете две конструкции.
10. Под микроскопом (20-кратное увеличение) с помощью микроножниц удалите сухожилие и соединительную ткань из глубокого слоя кожного трансплантата. Следите за тем, чтобы в привое не проделались отверстия. Истонченный дермальный трансплантат должен быть слегка непрозрачным, содержать только дерму, размером примерно 0,5 см х 1,0 см.
11. Поместите в марлю, смоченную солевым раствором, до готовности к изготовлению конструкции C-RPNI. Прививки следует использовать в течение 2 часов после забора.

2. Подготовка мышечного трансплантата

:

1. Сделайте продольный разрез вдоль передней части нижней задней конечности от чуть выше лодыжки до чуть ниже колена с помощью скальпеля #15. Рассекайте подкожную клетчатку, чтобы обнажить подлежащую мускулатуру.
2. На дистальной стороне разреза обнажите сухожильные вставки мускулатуры нижней конечности. Передняя большеберцовая кость (ТА), как правило, является самой большой и самой передней мышцей, и непосредственно под ней и позади этой мышцы находится длинный разгибатель пальца (EDL). Изолируйте дистальное сухожилие EDL от других сухожилий в этой области, стараясь не разрезать его вставку.
3. Обеспечьте изоляцию правильного сухожилия, вставив оба зубца щипца под сухожилие и оказывая давление вверх, открывая щипцы для смещения сухожилия. Манипуляции с этим сухожилием должны привести к одновременному разгибанию всех пальцев ног.
4. Выполните дистальную тенотомику острыми ножницами по радужной оболочке и отделите мышцу от окружающих тканей тупыми ножницами (или другими ножницами с тупым концом), работая проксимально, чтобы найти сухожильный источник.
5. После того, как проксимальный отдел сухожилия будет визуализирован, снова выполните тенотомию острыми ножницами радужной оболочки. Поместите мышечный трансплантат в марлю, смоченную солевым раствором, чтобы предотвратить высыхание.
6. После того, как все желаемые трансплантаты были удалены у донорской крысы, усыпляют сначала путем внутрисердечной инъекции KCl (1-2 mEq K+/кг) с последующей вторичной эвтаназией с помощью двустороннего пункционного пневмоторакса с помощью лезвия #15.

3. Общая изоляция малоберцового нерва и препарат

1. Обезболить и обеспечить обезболивание подопытной крысы в соответствии с протоколом, изложенным в пунктах 1.1-1.3.
2. Побрейте нужное бедро и очистите его спиртом, бетадином, а в конце – спиртом, чтобы удалить следы бетадина.
3. Переместите животное со стола для подготовки к хирургическому микроскопу и положите его на грелку с датчиком температуры для поддержания температуры тела. Поддерживайте изофлуран в концентрации 2-2,5% и кислород в дозе 0,8-1 л/мин.
4. Отметьте разрез, простирающийся от дистального отдела до седалищной выемки до нижней части колена. Эта маркировка должна быть ниже бедренной кости и находиться под углом от нее. Сделайте надрез лезвием #15, разрезая нижележащую фасцию бицепса бедра.
5. Осторожно рассеките двуглавую мышцу бедра с помощью гемостата или микроножниц с тупым концом до пространства, лежащего под двуглавой мышцей бедра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Седалищный нерв проходит примерно в том же направлении, что и первоначальный разрез, который был сделан. Существует три ветви, обычно с задней частью икроножного нерва и общим малоберцовым и большеберцовым нервами, проходящими поверхностно и глубоко к колену соответственно.
6. После идентификации общего малоберцового нерва (ДЦП) с помощью пары микрощипцов с тонким наконечником и микроножниц осторожно изолируйте нерв ЦП от других ветвей седалищного нерва и удалите любую оставшуюся соединительную ткань дистально.
7. В точке, где нерв пересекает поверхность колена, резко пересеките нерв микроножницами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование острых ножниц чрезвычайно важно на этом этапе, так как нанесение значительной травмы нерва может увеличить риск образования невриномы.
8. Осторожно освободите оставшуюся соединительную ткань от нерва ЦП и работайте проксимально, чтобы освободить нерв на длину примерно 2 см.

4. Изготовление конструкции C-RPNI

:

1. Извлеките мышечный трансплантат из марли, смоченной солевым раствором, и удалите всю центральную сухожильную ткань, а также небольшой центральный сегмент эпимизии. Оставьте сухожильные концы нетронутыми.
2. Использование 8-0 Нейлоновый шов, закрепить эпиневрий перерезанного конца нерва ЦП в области мышечного трансплантата, лишенного эпимизиума, двумя прерывистыми швами с каждой стороны нерва.
3. Закрепите мышечный трансплантат на надкостнице бедренной кости одним прерывистым стежком из нейлона 6-0 как проксимально, так и дистально, при этом нервно-мышечное соединение должно быть обращено в сторону от бедренной кости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Закрепите мышцу так, чтобы она находилась на нормальной, расслабленной длине. Старайтесь не растягивать мышцу значительно и не оставлять слишком много дряблости при закреплении.
4. Ставка 8-0 Нейлоновый шов на нижнем, центральном крае эпимизиума мышечного трансплантата, прикрепляя его к эпиневрию нерва ЦП таким образом, чтобы создать дряблость нерва внутри мышечного трансплантата и помочь снять любое напряжение в будущем, которому он может подвергнуться при последующей ходьбе.
5. Извлеките кожный трансплантат из увлажненной солевым раствором марли и расположите его на мышечном трансплантате таким образом, чтобы полностью покрыть нерв и большую часть мышцы. Убедитесь, что глубокий край дермы упирается в мышцу. Обрежьте любую дерму, которая выходит за границу мышцы.
6. Закрепите кожный трансплантат на мышечном трансплантате по окружности с помощью 8-0 Нейлоновые прерывистые швы. Как правило, используется 4-8 швов в зависимости от размера конструкции.
7. Закройте фасцию бицепса бедра над конструкцией в беговой манере хромическим швом 5-0.
8. Закройте вышележащую кожу хромированным швом 4-0 по беговой схеме.
9. Промокните операционную область спиртовой салфеткой и нанесите мазь с антибиотиком.
10. Прекратите ингаляционный анестетик и дайте крысе восстановиться с помощью источников пищи и воды, отделенных от соседей по клетке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
#15 Скальпель	Aspen Surgical, Inc	Ref 371115	ребристые хирургические лезвия из углеродистой стали (#15)
4-0 Chromic Suture	Ethicon	SKU# 1654G	P-3 Игла обратной резки
5-0 Chromic Suture	Ethicon	SKU# 687G	P-3 Игла для обратной резки
6-0 Ethilon Suture	Ethicon	SKU# 697G	P-1 Игла для обратной резки (нейлоновый шов)
8-0 Монофиламентный шовный материал	AROSurgical	T06A08N14-13	Черный полиамидный монофиламентный шов на нитевой конической игле
Экспериментальные крысы	Envigo	F344-NH-sd	Крысы - это Fischer F344 Штамм
Fluriso (Isofluorane)	VetOne	13985-528-40	Ингаляционный анестетик
Микромотор Высокоскоростная дрель с камнем	Master Mechanic	Model 151369	Ручной вращающийся инструмент; в комплект входят несколько камней мелкой крупности
Кислород	Криогенные газы	UN1072	Стандартные медицинские кислородные баллончики
Хлорид калия	APP Pharmaceuticals	63323-965-20	Инъекционная форма, 2 мг-экв/мл
Повидон Йод USP	MediChoice	65517-0009-1	10% раствор для местного применения, можно использовать один флакон для нескольких хирургических приготовлений
Puralube Vet Opthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38	Защитная мазь роговицы для использования во время процедуры
Rimadyl (Caprofen)	Zoetis, Inc.	NADA# 141-199	Инъекционная форма, 50 мг/мл
Стереомикроскоп	Leica	Model M60	Пользователь может регулировать увеличение по своему усмотрению
Хирургические инструменты	Инструменты для тонкой науки	Различные	пользователи могут выбирать инструменты в соответствии с личными предпочтениями или из того, что в настоящее время доступно в их лаборатории
Мазь с тройным антибиотиком	MediChoice	39892-0830-2	Мазь выпускается в стерильных одноразовых пакетиках
VaporStick 3	Surgivet	V7015	Анестезиологическая башня с местом для изофторана и кислородного баллончика
Webcol Alcohol Prep	Coviden	Ref 6818	Спиртовые салфетки для подготовки; используйте новую салфетку для каждой подготовки