Механическое раздражение Стволовые клетки Использование Циклические одноосной деформации

Краткое содержание

Это широко известно, что механические силы в организме может влиять на дифференциации и пролиферации клеток. Здесь мы представляем видео-протокол, демонстрирующие использование заказных биореактор для доставки одноосной деформации растяжения циклических со стволовыми клетками, культивируемые на гибких подложках micropatterned.

Аннотация

Роль механических сил в развитие и поддержание биологической ткани хорошо документирована, в том числе несколько механически регулируемые такие явления, как костного ремоделирования, мышечной гипертрофии, пластичность и гладкой мышечной клетки. Однако силы, участвующие зачастую крайне сложным и трудным для мониторинга и контроля в естественных условиях. Для того чтобы лучше изучить влияние механических сил на клетки, мы разработали в пробирке способ применения одноосной деформации растяжения циклические к прилипшие клетки культивировали на упругие мембраны. Этот метод использует специально разработанный биореактор с моторизованной камеры ротора система применить желаемую силу. Здесь мы представляем шаг за шагом, видео-демонстрации того, как протокол для сборки различных компонентов каждого "растянуть камера", в том числе, в данном случае, силиконовая мембрана с micropatterned топографии ориентироваться клеток с направлением деформации. Мы также описываем процедуры стерилизации камеры, посев клеток на мембране, фиксации камеры в биореакторе, а также настройка механических параметров (например, величины и скорости деформации). Процедуры, изложенные в данном протоколе, специфичные для посева мезенхимальных стволовых клеток человека на силиконовой мембраны с 10 мкм широкие каналы ориентированы параллельно направлению деформации. Тем не менее, методы и материалы, представленные в этой системе являются достаточно гибкими, чтобы приспособить количество вариаций на эту тему: скорости деформации, величины, продолжительности, типа клеток, мембран топографии, мембранного покрытия и т.д. могут быть адаптированы к нужного приложения или результат. Это надежный метод исследования эффектов одноосной деформации растяжения, примененных к ячейкам в пробирке.

Протокол

День 0 - Стерилизация до дня эксперимента

1. Положите материалов в пластиковые ванны и стерилизовать 70% спиртом в течение 2 часов:
   • Палатах
   • Крышки
   • Рамки (все 3 штуки)
   • Винты
   • Резиновые прокладки
   • Щипцы
   • Ножницы
   • Шестигранные ключи
2. Чистая мембран с Aquet мыла и дистиллированной воды.
3. Разрушать ультразвуком мембран в 70% спирте в течение 10 минут.
4. Место чистой мембраны в пластиковые квадратные блюда. При использовании узорной мембран, убедитесь, что узорной сторона лицевой стороной вверх (спрей алкоголя на одну сторону мембраны и следить за жидкость стекать канавки).
5. Оставьте мембраны покрыты 70% спирта в течение 2 часов.
6. Пакет перчатки в алюминиевую фольгу для автоклавирования завтра утром.
7. Сделайте 2% (вес / объем) раствора желатина (2g/100mL) в дистиллированной воде для автоклавирования завтра.
8. После 2 часов стерилизации в 70% спиртом, поместите все полимерных материалов и мембран (не автоклавируемый материалов) в капоте для ночного УФ:
   • Палатах
   • Крышки
   • Рамки (все 3 штуки)
   • Мембраны
9. Остальные обновления материалов в автоклавируемый мешок:
   • Винты
   • Резиновые прокладки
   • Щипцы
   • Ножницы
   • Шестигранные ключи

День 1 - Монтаж натяжных камер

1. Автоклав щипцы, ножницы, шестнадцатеричные ключи, болты, прокладки, перчатки, и желатин с использованием малых автоклаве при температуре 240 ° F в течение 20 минут общего
2. Удалить мембран от УФ и обработать плазмой O ₂ (узорные стороной вверх) для ~ 1 минуту.
3. В капоте ТС, крышка узорной области плазмы рассматривается мембран с желатином. Пальто 30 минуты под УФ.
4. Промыть каждую мембрану с PBS 2X. После второго мытья, оставить некоторые PBS на мембранах, чтобы держать их скользкими, для облегчения сборки в камерах. (Если использовать эту PBS для смазки прокладок для облегчения сборки).
5. Соберите мембран в камеры (износ автоклавного перчатки во время сборки)
   1. Подключение двух основных частей каркаса с помощью одного винта.
   2. Флип кадр снова и место мембраны на вершине, так что желатин покрытием боковых поверхностей к раме (узорные области должны быть в центре).
   3. Безопасные мембраны раме с помощью прокладки на каждой стороне.
   4. Пресс прокладки, используя нежные, даже давление, чтобы не разорвать мембрану.
6. Прикрепите собранный кадр T-бар.
7. Флип кадра и поместить в камеру с ног на голову. УФ стороне задней раме и мембраны в течение 30 минут
8. Флип кадр еще раз, и винт на камеры (без изменений для управления камерой, но для натяжных камеры, необходимо использовать два винта, чтобы прикрепить конец кусок кадра на дно камеры, и необходимо удалить одним винтом, который проведение двух частей кадра вместе). УФ-лицевую сторону в течение 30 мин. Убедитесь, что мембраны полностью высохнуть, прежде чем переходить к следующему шагу, иначе клетка решение может соскользнуть во время посева.
9. Семенной клеток. Площадь 1 пластина = 3 Площадь мембраны, так что используйте 1 / 3 от сливной пластины в мембране. Используйте 1 мл клеточной раствора на мембране. Любой более 1,5 мл будет трудно сохранять раствор далее. Положите клетка решение только на узорной области, а также использовать пипетки распространять решения вокруг. Обложка камер и пусть клетки приложить на 30 минут РТ в капюшон.
10. Перемещение камеры в инкубатор и пусть клетки прикрепите еще 1 час. Будьте очень осторожны, движущихся камер, чтобы избежать позволяя клетка решение соскользнуть! Клеток в том, что камера будет разрушен, если решение падает в этой точке.
11. Вернуться к камере капот и добавить 20 мл СМИ.
12. Место камер в спиртовой ванне очищают, которая покрыта алюминиевой фольгой (также распыляются с алкоголем). Перемещение камеры, чтобы растянуть инкубатора (10% CO _2).
13. Безопасные камер в растянуть машину. Давайте клетки дальнейшем приложите на ночь, и начать растягивать на следующий день. (Примечание: при вводе в камерах растянуть машину, не забудьте заблокировать машину в «нулевой» позиции перед размещением камер и затяните резинкой вокруг передач Не забудьте разблокировать передач перед запуском машины.).

Обсуждение

Бэйнс и соавт. первые сообщили об использовании системы для механической стимуляции клеток в пробирке с помощью гибкой подложке эластомерных доставить механической силы к клеткам ^1. Начиная с этого времени, много вариаций на эту дизайна были задуманы и реализованы. Несколько механических систем растянуть имеются в продаже под названием "Flexercell" (Flexcell Международная корпорация), в то время как некоторые лаборатории использования заказных устройств. В этом видео протокола мы описали установку и использование одной ...

Материалы

Заметки о средствах массовой информации: Эти эксперименты одноосном растянуть склонны к загрязнению из-за сложности биореактор установки. Для борьбы с этим, мы постарались различные комбинации антибиотиков и противогрибковых средств. 1% Fungizone правило, необходимо, наряду с комбинацией антибиотиков. Либо использовать Pen / Strep комбинации, либо использовать сочетание канамицину и гентамицину (но не пытайтесь с помощью комбинации / коктейль из трех или более антибиотиков вместе, как это может привести к устойчивым мутантов бактерий, а также может иметь пагубные последствия для клеток) .