Биолюминесцентная визуализация прогрессирования опухоли молочной железы на мышиной модели самки

Аннотация

Источник:
Марина Арантес Радикки¹, Виктор Карлос Мелло¹,
Victória Paz Machado¹, Márcia Cristina Oliveira da Rocha¹, Jaqueline Vaz de Oliveira¹, Luana Cristina Camargo^1,2, Luís Alexandre Muehlmann¹, Ricardo Bentes Azevedo¹, Sônia Nair Bao¹, João Paulo Figueiró Longo<sup>1

1</sup>Институт биологических наук, Университет Бразилиа, ²Отделение основных психологических процессов, Институт психологии, Университет Бразилиа

В этом видео демонстрируется процедура отслеживания прогрессии опухоли in vivo путем введения клеток аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих люциферазу, самке мыши и мониторинга биолюминесцентных сигналов для оценки роста первичной и метастатической опухоли с течением времени

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Культура клеток

1. Поддерживайте клеточную линию 4T1 (ATCC-CRL-2539), клетку аденокарциномы молочной железы мышей, в культуре со средой DMEM (модифицированная орлиная среда Дульбекко) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (v:v), пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 Ед/мл), при 37 °C и во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2.
2. Трансфектируйте исходную клеточную линию геном Luc2, который экспрессирует люциферазу. Этот биолюминесцентный фермент вырабатывается конститутивно.

2. Животная модель - Трансплантация опухолевых клеток

1. Подкожно инокулировать биолюминесцентные, экспрессирующие люциферазу клетки 4T1 (2 × 10⁵ клеток на мышь) в левую спинку самок мышей Balb/c под анестезией (кетамин и ксилазин в дозах 80 мг/кг и 10 мг/кг соответственно).
   1. Для этой процедуры мышь обезболивают перед началом эксперимента с помощью внутрибрюшинного введения указанных анестетиков (кетамин и ксилазин в дозах 80 мг/кг соответственно).
   2. Через 5 минут после индукции анестезии побрейте мышь и введите клетки подкожно с помощью инсулиновых шприцев объемом 1 мл.
      Примечание: В общей сложности пять 8-недельных мышей, весом около 25 г каждая, были использованы для индукции опухоли и визуализации.
2. Чтобы количественно оценить рост опухоли in vivo, оцените мышь-носительницу опухоли с помощью биолюминесцентной визуализации, наблюдая за ростом опухоли в течение 4 недель.
   1. Для экспериментов с биовизуализацией обезболивайте мышь изофлураном (2,5% разведенным в очищенном сжатом воздухе). Чтобы оценить прогрессирование опухоли, визуализируйте мышь один раз в неделю в течение 4 недель с помощью оборудования, которое измеряет биолюминесцентные сигналы.
      ЗАМЕТКА: Биолюминесцентный сигнал 4T1-luc люциферазы использовался в качестве параметра для оценки роста и указания на прогрессирование опухоли.
3. Во время процесса визуализации расположите мышь в дорсальном лежачем положении в пределах отведенной для этого области оборудования, чтобы получить биолюминесцентные изображения.
4. После анестезии введите мышке D-люциферин (100 μл; 15 мг/мл) внутрибрюшинно.
   ЗАМЕТКА: Поскольку D-люциферин является субстратом для фермента люциферазы, который при расщеплении образует световые фотоны, а клетки 4T1-биолюминесцентной люциферазы конститутивно экспрессируют этот фермент, количественно определяют и обнаруживают опухоль у живых животных.
5. Чтобы обнаружить сигналы, сделайте 20 биолюминесцентных изображений в течение 20 минут для каждого животного в каждой конечной точке. Каждое из этих изображений представляет собой биолюминесцентный сигнал, излучаемый в течение 60 с.
6. Постройте кривую биолюминесцентной кинетики, представляющую сигнал, излучаемый каждую минуту. Чтобы обеспечить оптимальные результаты для каждого животного, регистрируйте максимальное биолюминесцентное излучение для каждой конечной точки.
7. Для получения биолюминесцентного изображения используются следующие параметры: эмиссионный фильтр открытый, без возбуждения, биннинг 8, f/stop 2 и поле зрения типа D. Чтобы построить кривую роста, визуализируйте животных один раз в неделю в течение 4 недель.
8. Биолюминесцентная визуализация - первичные опухоли и метастазы в легкие.
   1. Чтобы отличить первичную опухоль от сигналов метастазирования в легкие, определите конкретные области интереса с помощью программного обеспечения оборудования.
   2. Определите биолюминесцентные сигналы в месте инъекции и в грудной области, где клетки метастазировали. На основе этих изображений рассчитать прогрессирование биолюминесцентного сигнала, который сильно коррелирует с прогрессированием опухоли.
   3. С помощью изображений, собранных в течение нескольких недель, создайте профиль кинетики роста для различных участков опухоли, включая первичную опухоль и метастатические поражения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
D-люциферин	Перкин Элмер	122799	Химический реагент
Модифицированный Eagle's médium от Dulbecos	Гибко	А7030	Среды для клеточных культур
Фетальная бычья сыворотка	Мерк	Ф2442	Пищевая добавка для клеточных культур
Изофлуран	Cristália	NA	Анестетиков
IVIS Lumina	XR	Серия III	Оборудование – США
Пенициллин	Мерк	П4333	Антибиотик для клеточных культур
Фаллоидин-Алекса Флюор 488	Термо Фишер	А12379	Химический реагент
Фосфатный буферный раствор	Мерк	4437568	Химический реагент
Стрептомицин	Мерк	П4333	Антибиотик для клеточных культур