Прямая доставка MIF Morpholinos Into данио рерио отоцист путем инъекций и Электропорация влияет на внутреннее развитие уха

Краткое содержание

Метод доставить morpholinos непосредственно в данио отоцист на 24hpf была разработана. Использование микроинъекции morpholinos в просвет слухового пузыря и электропорации осуществить проникновение, мы смогли обойти влияние morpholinos на мозг и получить эффекты, характерные для внутреннего уха.

Аннотация

В последние годы электропорации стала популярная техника для прижизненного трансфекции ДНК, РНК и morpholinos в различные ткани, включая глаза, головной мозг, и сомитов из рыбок данио. Преимущество электропорации по сравнению с другими методами генетических манипуляций в том, что специфические ткани могут быть направлены, как в пространстве и во времени, для введения макромолекул путем применения электрического тока. Здесь мы опишем использование электропорации трансфекции и MIF MIF-как morpholinos в тканях развивающегося внутреннего уха рыбок данио. В прошлых исследованиях, MIF морфолино вводят эмбрионов на 1 - 8-клеточной стадии привело к широкому распространению морфологические изменения нервной системы и глаз, а также ухо. По ориентации ткани внутреннего уха на более поздних стадиях развития, мы можем определить первичный эффект MIF в развивающемся внутреннем ухе, в отличие от вторичных эффектов, которые могут возникнуть в результате влияния других тканях. При использовании фаллоидином и ацетилированного тубулина окрашивания для изучения морфологии нейронов, нейронных процессов, а волосковых клеток связана с задним макулы, мы смогли оценить эффективность электропорации в качестве метода для целевой трансфекции в данио внутреннего уха. Слуховых пузырьках из 24hpf эмбрионы были введены с morpholinos и электропорации, а затем были по сравнению с эмбрионами, которые не получали лечения, либо были только вводили или электропорации. Эмбрионы, которые были введены и электропорации показали снижение численности волосковых клеток, снижение иннервации по statoacoustic ганглии (SAG) и меньше SAG нейронов по сравнению с контрольными группами. Наши результаты показали, что прямые поставки morpholinos в otocysts на более поздних этапах позволяет избежать неспецифической нервной системы и нейронные эффекты гребне morpholinos доставлен в 1-8 клеточной стадии. Она также позволяет исследовать эффекты, которые направлены на внутреннее ухо, а не вторичные эффекты на ухо от первичного воздействия на мозг, нервного гребня или околоушный мезенхимы.

Протокол

1. Создание Электроды для Электропорация

1. Вырезать 75 мкм в диаметре вольфрамовой проволоки (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) подходящей длины (около 3-5 см)
2. Положите вольфрамовой проволоки через кабельный разъем Molex (контакт штамп латунь)
3. Оберните вольфрамовой проволоки и Molex разъем кабеля с помощью термоусадочной трубки (SPC технологии, Чикаго, Иллинойс) и нагревать с Бунзена горелки или фена для герметизации сокращение трубки на проводе
4. Чтобы заострить кончик вольфрамовой проволоки, погрузите провод в 1,0 гидроксида натрия N (Conrad и соавт. 1993) и, используя скрепки, как другой электрод, электролиза провод с площади Electroporator Wave. Условиях мы используем, 5 50-вольтовая импульсов продолжительностью 100 мс с 50 мс между импульсами. Электроды должны быть заточены, чтобы диаметр 15-20 мкм
5. Держите провода в лоток в пазы вдавливается в пластилин до использования в электропорации

2. Настройка Электропорация станции

1. Лента заостренными электродами 75 мкм вольфрама до микроманипуляторами (инструменты Всемирного Precision).
2. Место микроманипуляторами по обе стороны от вскрытия столик микроскопа (Leica).
3. Подключите электроды к Защитить СиУ-21 Изменить площади волна Electroporator (рис. 1).
4. Включите electroporator и настроить параметры для электропорации, в том числе напряжения, длительность импульса и количество импульсов. Наиболее эффективные параметры для этого эксперимента было установлено, что три 13-вольтовых импульсов, каждый длился 5.0ms, с 100 мс между каждым импульсом. Если электропорации создает воздушные пузырьки в эмбрион, уменьшить длительность импульса.

3. Микроинъекции Morpholinos Into данио рерио слуховым пузырьком

1. Урожай данио эмбрионов из разведения танк. Инкубируйте эмбрионов в зародыше средств среде с 0,3 PPM метиленовый синий (Уэстерфилд, 2005) на 28,5 ° С в течение ночи.
2. Вытяните стекла иглы с Саттер Р-97 электрод съемник
3. Разминка агарозном геле базы (1% агарозы в рыбе воды в 10 мм блюдо Петри) до 37 ° С на водяной бане
4. Нагрейте 1% низкой температурой плавления агарозы (LMPA) в воде, пока рыба плавится и сохранить его тепло 37 ° С водяной бане.
5. Наполните стакан игла с решением морфолино (GeneTools, Корваллис, OR) и вырезать наконечник соответствующего диаметра. Горы инъекционной иглой на микроманипулятора (Kuhn).
6. Отрежьте кончик иглы примерно до 10 мкм и впрыснуть в минеральное масло для того, чтобы наконечник позволяет достаточным поставку решения морфолино.
7. Dechorinate эмбрионов на 24 часов функции организма крыс (HPF) и обезболить их MS222 (tricaine, Sigma) в 0,3 PPM метиленовый голубой воды рыбу.
8. Совместите 3 до 5 наркозом эмбрионы на базе агарозном геле с правой стороной вверх для удобного анализа равномерное
9. Положите 1 по 2 капли 1% LMPA за каждый эмбрион и пусть укрепит исправить эмбриона на месте
10. Поворот чашке Петри, чтобы слухового пузыря находится на правой стороне
11. Место иглу в просвет слухового пузыря и внедрить решение морфолино с PV820 пневматический PicoPump (инструменты Всемирного Precision) с прикрепленным резервуар азота (рис. 2)

4. Процедура Электропорация

1. Перемещение установлен эмбрионов электропорации станции сразу после инъекции
2. Место положительного электрода на ткани как раз позади слухового пузырька, но не проникают; вставить отрицательного электрода в мозг только впереди слухового пузырька
3. Применить тока с помощью ножной педали или нажатием переключателя.
4. Залить рыбу водой на агарозном и удалить эмбрионов из агарозы с крутящихся и стеклянную пипетку. Будьте осторожны, чтобы не повредить эмбрионов. Для эмбрионов, которые трудно удалить, используйте иглу, чтобы аккуратно порвать любого LMPA окружающих эмбрион.
5. Место эмбрионов в тарелку с метиленовым синим рыбы и поднять эмбрионы желаемого этапов для анализа (морфологического, иммуногистохимического, на месте anlaysis гибридизации, и т.д., и микроскопические).

5. Представитель Результаты:

Рисунок 1. Электропорация станции. Электроды были сделаны с помощью заостренными 75 мкм провода вольфрама и связанных приводит к Защитить СиУ-21 Изменить Electroporator Волна площади. Эти электроды были записаны на пленку, чтобы микроманипуляторами.

Рисунок 2. Инъекции станции. Все эмбрионы были введены в правое ухо по стандартизации целей.

Рисунок 3. Фаллоидином окрашивания нитей актина с 3 эмбрионов DPF. (А) 3 денье эмбриона injecteг с управлением МО имеет сильное окрашивание фаллоидином в задней макулы (вторая половина дня). (B) эмбриона который был введен с контролем МО, а затем электропорации были подобные уровни окрашивания фаллоидином в пм в инъекции только эмбрионы. (C) Инъекция с MIF МО в слуховым пузырьком в одиночку не может привести к снижению окрашивания фаллоидином, в то время как инъекции MIF МО вместе с электропорации вызвало резкое сокращение окрашивания фаллоидином в час (D). Я, передней макулы.

Рисунок 4. Фаллоидином окрашивания нитей актина с 5 DPF личинок. Существовал никакой разницы между инъекции только (А) и инъекции электропорации, когда стандартный элемент управления морфолино был использован (B). Тем не менее, 5 DPF личинки, которые были введены с MIF morpholinos и электропорации показали снижение фаллоидином окрашивания в задней макулы (вторая половина дня) (D), хотя и менее драматично, чем 3 денье, по сравнению с эмбрион, который был введен с MIF morpholinos только (C ). Я, передней макулы.

Рисунок 5. Ацетилированный окрашивания тубулина эмбрионов на 3 денье. Эмбриона в (А) не получили никаких инъекций или электропорации. Эмбриона в (Б) была электропорации но не получил инъекцию. Эмбрионы, получающих одновременно инъекции и электропорации (C, D) с MIF morpholinos было заметно уменьшилась окрашивания тубулина по сравнению с контрольной группой. (Вторая половина дня, задним макулы).

Рисунок 6. Ацетилированный окрашивания тубулина эмбрионов на 3 денье с контролем морфолино. (А) эмбрионов без какого-либо лечения показал сильную ацетилированного окрашивания тубулина в задней макулы (вторая половина дня) и обширные иннервации. (B) эмбрионов вводят контроль морфолино. (C) эмбрионов получавших только электропорации. (D) Управление эмбриона с контролем морфолино вводили и электропорации имеет одинаковый уровень ацетилированного тубулина в задней макулы и иннервации по сравнению с отсутствием лечения контроль.

Обсуждение

Мы успешно внедрили МО антисмысловых олигонуклеотида в ухо 24 эмбрионов данио HPF. Эмбрионы, которые были поставлены после инъекции и электропорации были жизнеспособными. Если эмбрионов выжили электропорация, они выросли по обычным ставкам по сравнению с эмбрионами, которые не получали лечения, а также эмбрионы, которые только были введены и эмбрионов, которые были только электропорации.

Мы наблюдали эффект MIF и MIF-МО, как после инъекции уха и электропорация с помощью маркировки с фаллоидином и ацетилированного тубулина. Фаллоидином окрашивания актиновых филаментов в волосковых клеток задней макулы указывает, что электропорации MIF и MIF-MO, как в 24-HPF этапе вызванные изменениями в волосковых клеток и / или стереоцилий номера по сравнению с эмбрионами, которые только вводят МО (рис. 3). Это снижение численности волосковых клеток согласуется с выводами Шень и соавт. (Представлено), что МО в MIF и MIF-как причина сокращения числа волосковых клеток в саккулярной макулы. Снижение численности волосковых клеток в эмбрионы, которые были введены с МО и электропорации продемонстрировать, что электропорации может помочь в продвижении МО через клеточную мембрану, тем самым повышая степень морфологические эффекты по сравнению с эмбрионами, в котором слуховым пузырьком только вводили. Изменения в морфологии statoacoustic ганглия наблюдали через ацетилированного окрашивания тубулина. Степени иннервации по statoacoustic ганглия пострадал, так как эмбрионы, которые были введены и электропорации шоу снизилась ветвление нейритов (рисунок 5). Там также может быть уменьшен конденсации ганглиозных клеток и / или снижение количества ганглиозных клеток, так как ацетилированный окрашивания тубулина значительно уменьшились в эмбрионов, которые были и вводят и электропорации. Потому что MIF было показано, что иметь решающее значение для развития нервной системы (Suzuki и соавт., 2004), изменения, наблюдаемые после электропорации может быть результатом увеличения трансфекции и MIF MIF-MO, как раствор в нейробластов клеток.

Электропорация антисмысловых олиго morpholinos непосредственно в развивающихся тканей является полезным инструментом для управления экспрессию гена в процессе развития, что ткани, оба во времени и пространстве, в зародыше. Электропорация Мифа и MIF-МО, как в ткани внутреннего уха в результате ненормальной морфологии оба задних макулы и statoacoustic ганглия. Существовал сокращение числа волосковых клеток в задней макулы у эмбрионов, которые были введены и электропорации по сравнению с эмбрионами, которые не получали лечения или эмбрионов, которые были либо только вводят или только электропорации. Существовал также снижение степени иннервации задних сенсорных патч statoacoustic ганглия и размер SAG. Электропорация является ценным методом трансфекции макромолекул в конкретной ткани, с выгодой для наблюдения первичных эффектов, что особенно ДНК, РНК, или МО в нужной ткани и дискриминацию их от вторичных эффектов на другие ткани, в том числе головного мозга, нервного гребня и околоушный мезенхимы на внутреннее развитие уха (Barald и Келли, 2004).

Материалы

1. МО: 0,3 мМ сочетание для MIF, MIF-как MO1 и MIF-как MO2 был использован.
   Миф МО бесплатный стартовый кодон мРНК данио МИФ: 5'-acatcggcatgactgcgacagagat-3 '. Два МО были использованы для MIF-как MIF-как MO1 бесплатный сайт поступательного старт:. 5'-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 ', в то время как MIF-MO2 основе AS последовательности в intron1/exon 2 границы: 5'-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 '. Управления МО был вскарабкался нуклеотидной последовательности гена из Tools: 5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 '.
2. метиленовый синий (0,3 промилле) в рыбе воду
3. MS222 (tricaine, Sigma; 0,64 мм в рыбе вода)
4. Низкий плавления агарозы (LMPA; Roche)
5. фенола красного (Sigma)
6. Анти-ацетилированного тубулина (Sigma)
7. Alexa Fluor ® 488 антимышиного вторых антител (молекулярных зондов)
8. Техас красных фаллоидином (Molecular зондов)