$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Насекомые
- Navel orangeworm, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera: Pyralidae) колонии в нашей лаборатории возникла от моли собраны из миндальных деревьев в городе Фресно, штат Калифорния. Наша колония насекомых поддерживается в экологической палаты (Персиваль Inc, IA) при 28 ± 2 ° С, 75 ± 10% относительной влажности, и под 16:08 ч (свет: темно) фото режима.
- Новые моли собираются ежедневно, сексуальны, и переданы в пластиковые коробки (669 мл коробке для завтрака, 13 х 13 см, высота 4,5 см, Rubbermaid) предоставлено до 10 слоев воды пропитанные бумажные полотенца (Thirsty Ультра Абсорбирующие, 27,9 х 27,9 см ; Safeway). Коробка крышка отверстия для циркуляции воздуха. Такое расположение обеспечивает ~ 100% RH.
- Для электрофизиологические измерения мы используем 2-4 дней после появления моли, которые хранятся в условиях высокой влажности.
2. Электрофизиологические подготовка
- Бабочки (мужчины или женщины), мягко толкнул на кончике пипетки (200 мкл, США Научная Inc), которая, вырезанных из верхней иметь большой (около 2 мм) диаметр кончика. Моли мягко протолкнул другой конец с увлажненной заглушки папиросной бумаги до антенн и часть головы торчат из наконечника.
- Открытые голова иммобилизованные, покрывая голову без сушки глины (Claytoon, Ван Акен International, CA), оставляя небольшую часть одного глаза и две антенны подвержены. Этот препарат сделан на платформе ЕАГ микроманипулятора MP-12 (Syntech, Германия) между двумя держателями для электрода.
- Мы используем стеклянный электрод изготовлен из 1,0 мм боросиликатного капиллярная трубка с нитью (WPI Inc, штат Флорида) и тянут в модели P-97 микропипетки съемник (Саттер инструменты, Калифорния), чтобы получить микроэлектродов менее микрометра чаевые. Электроды обратно заполненные лимфатической сенсиллы звонка (Kaissling и Торсон 1980). Один электрод пронзает подвергается области глаз под микроскопом (Leica MZ75) и служит в качестве ссылки, в то время записи электрода вмещает две антенны. Для облегчения контактов, дистальных 1-2 члеников разрезают перед вставкой в записи электрода. Для записи сигналов от отдельных сенсилл, мы немного изменить эту установку котором записи электрод пронзил под микроскопом (Olympus BX51WI; 800x увеличение). Потенциалы действия записываются, вставив стеклянный электрод на базе сенсиллы. Сигналы усиливаются высокое сопротивление предварительного усилителя (Syntech, Германия) и подается в UB-ЦАП, которые будут проанализированы автономно с AUTOSPIKE программное обеспечение (Syntech, Германия). AC сигналы полосового фильтра от 100 до -10 000 Гц и потенциалов действия извлекают компьютеру с помощью AUTOSPIKE алгоритм, который отличает их от пика до корыта амплитудой от шума. Ответы отдельных нейронов рассчитываются как увеличить (или уменьшить) в действии частотный потенциал (шипы в секунду) по спонтанной частоты.
3. Химические раздражители и стимулирование протокола
- Химические вещества высшей чистоты. Основным компонентом женского смесь феромонов от пупка orangeworm, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal была получена из Bedoukian Research Inc, штат Коннектикут. Химические вещества растворяются, м / о, со стеклянными дистиллированной гексан, чтобы сделать запас решения 10 мкг / мкл и декадно разведения делаются. Аликвоты (10 мкл) стимул химического растворения в гексане загружается на Whatman фильтровальной бумаги полосы (8x40 мм), растворитель испаряется, осторожно покачивая в течение 10 с под вытяжным шкафом и полоса находится в 5 мл полипропилен шприц (BD Шприцы, штат Нью-Джерси), из которых различные объемы выбрасываемых. Гексан в покое и пустой шприц служить в качестве контроля.
- Подготовка проводится в увлажненной воздушного потока выступил контроллер Syntech Стимул (CS-55 модели; Syntech, Германия) со скоростью 20 мл / сек до которой стимул импульса 4 мл / сек добавляется в течение 500 мс. Сигналы записываются в течение 10 с, начиная с 2 сек до начала стимула импульса. Усиков подготовки стимулируется с 500 мс импульс в течение которого ок. 2 мл очищенного воздуха от 5 мл полипропиленовый шприц, содержащий стимул добавил на основной поток воздуха. Зазор не менее 1 мин и более, после высокой ответы, допускается между раздражениями.
4. Представитель Результаты
Антенны сдержанный моли (рис. 1) стимулировали женский компонент феромон, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal генерировать надежные ответы в зависимости от дозы (рис. 2). Это основной компонент феромона также вызывает дозозависимое возбуждающие ответы от долгого trichodea сенсиллы (рис. 3А), как показано на следы одной записи блока (рис. 3б).
Рисунок 1. Живая пупка orangeworm моли сдержанный и антенны подвержены
load/2489/2489fig2.jpg "ALT =" Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. Дозозависимым ответы ЕАГ вызвало в ответ на (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, главных женских учредительных феромона.
Рисунок 3. Сенсилл трихоидных в мужской пупка orangeworm моли реагировать на (Z, Z) -11,13-hexadecadienal в зависимости от дозы. () Антенна мужского пупка orangeworm моль мульти-сегменты и каждый сегмент украшена большим количеством волос, как структуры, сенсилл. Сканирующего электронного микроскопа, показывая подробные сведения на вставке (Масштаб бары 200 и 50 мкм соответственно). (B) Внеклеточные единичные записи с трихоидных сенсиллы.