Дрожжи колонии Вложение Метод

Summary

Метод для встраивания дрожжей колонии позволяет срезов для световой и электронной микроскопии. Этот протокол позволяет определить распределение спорулированных клеток и pseudohyphal клеток в колонии предоставления новым инструментом на пути к пониманию организации типов клеток в течение грибковых сообщества.

Abstract

Структурирования различных типов клеток в эмбрионы является ключевым механизмом в развитии многоклеточных. Сообщества микроорганизмов, например, колоний и биопленок также отображать модели типов клеток. Например, в дрожжах S. CEREVISIAE, спорулированных клеток и pseudohyphal клетки не равномерно распределены в колониях. Функциональное значение структурирование и молекулярные механизмы, лежащие в основе этих моделей по-прежнему плохо изучены.

Одна из проблем, по отношению к исследованию моделей типов клеток в колонии грибов является то, что в отличие от многоклеточных тканей, клеток в колонии относительно слабо соединены друг с другом. В частности, грибковых колоний не содержат обширную же уровня внеклеточного матрикса в большинстве тканей. Здесь мы сообщаем о методе вложения и срезов дрожжей колонии, который показывает интерьер модели типов клеток в этих колониях. Метод может быть использован для подготовки толстым слоем (0,5 μ) полезно для световой микроскопии и тонкие срезы (0,1 μ), пригодных для просвечивающей электронной микроскопии. Сумки и pseudohyphal клетки могут легко отличить от яйцевидной дрожжевых клеток с помощью световой микроскопии, в то время как внутренняя структура этих клеток могут быть визуализированы на EM.

Метод основан на окружающих колонии с агар, проникновение их со средними Сперр, а затем секционирования. Колонии диаметром в диапазоне 1-2 мм подходят для этого протокола. В дополнение к визуализации интерьера колоний, метод позволяет выявлять области колонию, которая вторгается основной агара.

Protocol

1. Изоляция колонии и фиксация

1. Инкубируйте 300 колоний на агаре средой для указанного времени (изолированные колонии должна быть на 1-2 мм в диаметре).
2. Удалить колонии (лицевой стороной вверх) и подстилающей среде с помощью узкого шпателя.
3. Место несколько капель 2% агара 42 ° С на предметном стекле микроскопа с использованием 1 мл pipetman наконечник и сразу же месте колонии на агаре лицевой стороной вверх перед она затвердевает.
4. Место несколько капель 2% агара 42 ° С на колонии и дать затвердеть.
5. Надевайте перчатки для всех шагов по оставшейся части этого протокола
6. Обрезка блока с лезвием бритвы и поместит....

Discussion

Метод, изложенный раскрывает внутренние структуры колоний. Потому что метод эффективен в определении структуры клеточных типов в диапазоне S. CEREVISIAE штаммов с различной морфологией колоний, а также в связанных с ними видов С. Парадоксальный ^5, метод, вероятно, также работы по широкому спектру грибков и других микроорганизмов.

Один важный шаг для успеха метода заключается в обеспечении всей колонии, в том числе верхней части колонии, заключен в агар всей протокола. Нез.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Тетраоксид осмия	Электронная микроскопия Sciences	RT 19152
Силиконовые формы для встраивания	Fisher Scientific	NC 9975029
Циклоалифатическая эпоксидная смола	Электронная микроскопия Sciences	RT 15004	ERL 4221
Эпоксидная смола	Электронная микроскопия Sciences	RT 13000	DER 736
Ноненил янтарный ангидрид	Электронная микроскопия RT	19050	NSA
2-диметиламин – танол	Электронная микроскопия Науки	RT 13300	DMAE
Монтажный материал	KPL Inc	71-00-16
Вращающееся колесо	Ted Pella, Inc.	Pelco 1055
Microtome	Leica Microsystems	Ultracut S