В этом видео, мы демонстрируем визуализации PKC транслокации в живых клеток с использованием флуоресцентной меткой PKCS.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Live-изображений PKC транслокации в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Протеинкиназа Cs (PKCS) являются серин треонин киназы, которые играют центральную роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как рост клеток и обучения и памяти. Есть четыре известных семейств PKC изоформ у позвоночных животных: классический PKCS (α, Pi, βII и γ), новый тип я PKCS (ε и η), новый тип II PKCS (δ и θ), и атипичная PKCS (ζ и ι ). Классическая PKCS активируются Са 2 + и diacylclycerol (DAG), в то время романа PKCS активируются DAG, но Са 2 +-независимой. Атипичные PKCS активируются ни Са 2 +, ни DAG. В Aplysia californica, наша модель системы для изучения формирования памяти Существуют три нервной системы конкретного PKC изоформы по одному от каждой основной класс, а именно: обычные PKC Apl я, новый тип я PKC Apl II и атипичных PKC Apl III. PKCS это липидные активированной киназы и, таким образом активация классического романа и PKCS в ответ на внеклеточные сигналы неоднократно коррелирует с РКС транслокация из цитоплазмы в плазматическую мембрану. Таким образом, визуализируя PKC транслокации в режиме реального времени в живых клетках стал бесценным инструментом для выяснения сигнальных путей, которые ведут к активации ПКС. Например, этот метод позволил нам установить, что различные изоформы PKC перемещать в различных условиях посредничество различных типа синаптической пластичности и серотонина (5НТ) активация PKC Apl II требует производства как DAG и фосфатидной кислоты (PA) для транслокация 1-2. Важно отметить, что способность визуализировать же нейрон неоднократно позволило нам, например, для измерения десенсибилизации PKC ответ в изысканными деталями 3. В этом видео, мы демонстрируем каждый шаг подготовки Sf9 клеточных культур, культур Aplysia сенсорные нейроны были описаны в другой видео статьи 4, выражая флуоресцентно меткой PKCS в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов и жить-изображений PKC транслокации в ответ на различных активаторов использованием лазерной сканирующей микроскопии.
Протокол
1. Подготовка и обслуживание Sf9 культурах клеток монослоя
- Sf9 культуре клеток и техническое обслуживание выполняется в капот культуры ткани.
- Sf9 клетки получены из Spodoptera frugiperda яичников клеток (Sf21 клеток) и могут быть приобретены как замороженные клетки в средствах массовой информации Грейс из Invitrogen.
- Место 8 мл насекомых среду Грейс, дополненная (1X), к которому 30% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) была добавлена в 75 см 2 клеточной культуре колбу с наклонным шеи.
- Оттепель замороженных трубки Sf9 клетки быстро в 37 ° С водяной бане, перемещая зонд вперед и назад (около 1-2 минут). <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы описали технику изображения транслокации флуоресцентно меткой PKCS в реальном времени в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов. Sf9 клетки обеспечивают простую систему, чтобы изображение PKC транслокации с культивированием и трансфекции их довольно просто. В противоположность этому, микроинъекции Aplysia сенсорных нейронов требуется некоторое время на освоение, до нескольких месяцев. Трудности, связанные с этой техникой включают электрод засорения. Фильтрация раствора для инъекций и центрифугиров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке канадских институтов здравоохранения (CIHR) Грант Wayne S. Sossin. Кэрол А. Фарах является обладателем докторской стипендий, начиная с де-ла-Fonds Recherche ан Santé Квебека (FRSQ) и Конрад Харрингтон общения. Авторы хотели бы поблагодарить Джоанна Бужи, Маргарет Гастингс и Маргарет Лаббан за помощь снимать видео и Мадлен Ричмонд бассейна за помощь в графическом обзоре.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Замороженные клетки Sf9 | <электронная микроскопия>Spodoptera frugiperda клетки яичников | Invitrogen | B825-01 | |
| Грейс’Среда для культивирования насекомых, дополненная (1X), жидкая | Реагент | GIBCO, от Life Technologies | 11605-094 | Используется для культивирования клеток Sf9 |
| Corning 75 см2 культуральный флакон с наклонным горлышком | Инструмент | Corning | 430720 | Используется для культивирования клеток Sf9 |
| Фетальная бычья сыворотка | Реагент | CanSera | CS-C08-500 | Дополнение Grace’среды с FBS перед использованием |
| Шприц | Инструмент | BD Biosciences | 309604 | Используйте для фильтрации раствора Fast Green |
| Шприц | Инструмент | BD Biosciences | 309602 | Используйте для фильтрации раствора плазмидной ДНК / Fast Green |
| Фильтр | Инструмент | Corning | 431229 | Используйте для фильтрации раствора Fast Green |
| Фильтр | Инструмент | Corning | 431212 | Используйте для фильтрации раствора плазмидной ДНК / Fast Green |
| Чашка со стеклянным дном | Инструмент | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Используйте для культивирования клеток Sf9 перед трансфекцией и визуализацией |
| Реагент Cellfectin II | Реагент | Invitrogen | 10362-100 | Используется для экспрессии флуоресцентно меченных протеинкиназ С (PKC) в клетках Sf9 |
| Fast Green FCF | Реагент | Sigma-Aldrich | F-7252 | Используйте для визуализации микроинъекции раствора плазмидной ДНК в <электронная микроскопия>Aplysia сенсорные нейроны |
| Стеклокапилляры с тонкими стенками | Инструмент | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Используйте для изготовления микр–электроды для микроинъекций |
| Наконечник для микродозатора (микролоадер) | Инструмент | Eppendorf | CA32950-050 | Перед использованием автоклавируйте [сосуд/контейнер] перед заполнением микро...–электроды для микроинъекций |
| Пневматический пико-насос PV820 | Инструмент | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Элементы станции для микроинъекций |
| Микр–держатель электрода | Инструмент | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Используйте для удержания микро-–электрод |
| Микроманипулятор | Инструмент | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Используйте для позиционирования микро-–электрод в трехосевой системе |
Ссылки
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
