Расширение, очистки и функциональной оценки периферической крови человека клетки NK

Краткое содержание

Здесь мы опишем метод эффективно расширить и очистить большое количество человеческих NK клеток и оценить их функцию.

Аннотация

Натуральные киллеры (NK-клетки) играют важную роль в иммунном надзоре против различных инфекционных микроорганизмов и опухолей. Ограниченная доступность NK-клеток и возможности их экспансии in vitro сдерживали развитие иммунотерапии на основе NK-клеток. Здесь мы описываем метод эффективной экспансии больших количеств функциональных NK-клеток ex vivo с использованием клеток K562, экспрессирующих мембраносвязанный IL21 в качестве искусственной антигенпрезентирующей клетки (aAPC).

Методы адоптивной терапии NK-клетками до настоящего времени основывались на использовании клеточного продукта, полученного путем лейкафереза донора в стационарном состоянии с последующим удалением Т-клеток или положительной селекцией NK-клеток. Продукт обычно активируют в IL-2 в течение ночи, после чего вводят на следующий день ¹. Из-за низкой частоты встречаемости NK-клеток в периферической крови в клинических исследованиях вводились относительно небольшие количества NK-клеток.

Невозможность размножения NK-клеток in vitro была ограничивающим фактором для получения достаточного количества клеток для достижения оптимального клинического результата. Определенного расширения популяции NK-клеток (в 5-10 раз за 1-2 недели) удалось достичь за счет применения только высоких доз IL-2 ². Активация аутологичных T-клеток может способствовать экспансии NK-клеток, вероятно, также за счет высвобождения локальных цитокинов ³. Использование мезенхимального стромального матрикса или искусственных антигенпрезентирующих клеток (aAPCs) может поддерживать экспансию NK-клеток как из периферической, так и из пуповинной крови ⁴. Комбинированная активация NKp46 и CD2 с помощью микросфер, покрытых антителами, в настоящее время предлагается на рынке для экспансии NK-клеток (Miltenyi Biotec, Auburn CA), что позволяет достичь примерно 100-кратного увеличения количества клеток за 21 день.

В настоящее время проводятся клинические исследования с использованием NK-клеток, экспандированных или активированных с помощью aAPC; в одном из них для прайминга и активации NK-клеток⁵ без значительного расширения популяции используется лейкозная клеточная линия CTV-1. Во втором исследовании для экспансии NK-клеток используются EBV-LCL, что позволило достичь среднего 490-кратного увеличения количества клеток за 21 день⁶. В третьем исследовании используются aAPC на основе линии K562, трансдуцированные 4-1BBL (CD137L) и мембранно-связанным IL-15 (mIL-15)⁷, что обеспечило среднюю 277-кратную экспансию NK-клеток за 21 день. Хотя NK-клетки, экспандированные с помощью aAPC K562-41BBL-mIL15, обладают высокой цитотоксичностью in vitro и in vivo по сравнению с неэкспандированными NK-клетками и участвуют в ADCC, их пролиферация ограничена сенесценцией, обусловленной укорочением теломер⁸. Совсем недавно было сообщено о 350-кратной экспансии NK-клеток с использованием K562, экспрессирующих MICA, 4-1BBL и IL15⁹.

Описанный здесь метод экспансии NK-клеток обеспечивает их быструю пролиферацию без наступления сенесценции, позволяя достичь медианного увеличения количества клеток в 21 000 раз за 21 день.

Протокол

1. Выделение МНПК от Баффи Coat

Мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) получаются плавучей центрифугирования плотности на Ficoll-Paque от здоровых доноров лейкомассы образцы полученных лейкафереза.

1. Ficoll-Paque центрифугирования делается как протокол на одного производителя с незначительными изменениями.
2. Добавить PBS к нормальной донорской крови-банк лейкомассы до конечного объема 140 мл (типичное пальто Баффи объем 40-70 мл).
3. Слой 35 мл образца пальто Баффи на 15 мл Ficoll-Paque (4 трубы).
4. Центрифуга при 400g в течение 20 минут без тормозов.
5. Восстановление МНПК от Ficoll-Paque: плазма интерфейс, не выбрасывайте эритроцитов на дне Ficoll-Paque.
6. Вымойте МНПК три раза PBS, центрифугирования каждый раз при 400g в течение 10 минут.
7. МНПК могут быть использованы непосредственно для НК расширения ячейки на этом этапе или NK клетки могут быть выделены путем RosetteSep (раздел 4)
8. Оставшиеся МНПК могут быть заморожены в ФБС, содержащего 10% ДМСО в жидком азоте.
9. Аспирируйте Ficoll и собирать эритроциты, начиная с шага 5 на две трубки центрифуги 50 мл, мыть три раза PBS (добавляют к 50 мл отметки), каждый раз аспирата супернатант скимминга верхней части слоя РБК удалить гранулоцитов.
10. Эритроциты могут быть использованы непосредственно для RosetteSep  очистки НК-клеток (см. раздел 4) или храниться в равном объеме решение Alsever это при 4 ° C для дальнейшего использования (эритроциты можно хранить в течение не более 4 недель).

2. Н. К. сотовый расширения

Расширение NK клетки может быть начато использование МНПК или очищенной NK клеток. Количество МНПК использоваться для расширения может варьироваться в зависимости от количества НК клетки желаемого в конце трехнедельного расширения, обратитесь к представителю результаты разделе. (См. примечание 1)

СТИМУЛЯЦИЯ 1

День 0

1. Для каждого 5x10 ⁶ МНПК быть расширен, считать и облучать 10x10 ⁶ К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр.
2. Сообщение облучения, мыть клетки с PBS и ресуспендируют в НК ячейки расширения носителя (NKEM).
3. Семенной 5x10 ⁶ МНПК с 10х10 ⁶ облученных К562 CL9 mIL21 (1:2) в 40 мл NKEM в T75 колбу и поместить его в вертикальном положении в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО _2.

Дни 3 и 5

4. Восстановление клетки центрифугированием при 400g в течение 5 мин и заменить половину средств массовой информации со свежими NKEM (добавление свежей Ил-2 для всего объема средств массовой информации) и продолжить культуры.

СТИМУЛЯЦИЯ 2

День 7

1. Подсчитайте количество клеток в культуре в конце недели.
2. Отложите 5х10 ^{5 клеток} для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2)
3. Для каждого 5x10 ⁶ ячеек, которые будут restimulated, считать и облучать 5x10 ⁶ К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр.
4. Добавить равное количество облученных К562 CL9 mIL21 (1:1) и ресуспендируют в NKEM на 2.5x10 ⁵ всего клеток / мл (см. Примечание 3).
5. Семенной клеток в колбах T75 (максимум 50 мл на флакон).

Дни 10 и 12

6. Подсчитайте количество клеток.
7. Изменение всей СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3).

День 14

8. В конце две недели расширения подсчета количества клеток в культуре.
9. Отложите 5х10 ^{5 клеток} для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2)
10. Если экспансия началась с МНПК NK клетки могут быть очищены на данном этапе расширение с помощью протокола RosetteSep очистки (см. раздел IV). Если расширение началось из очищенных натуральных киллеров переходите к стимуляции 3.
11. После очистки отложить 5х10 ^{5 клеток} для фенотипирование методом проточной цитометрии для проверки чистоты NK клеток (как в шаге 8).
12. Приступить к стимуляции 3, используя все очищенные клетки NK (См. примечание 4).

СТИМУЛЯЦИЯ 3

1. Ресуспендируют NK клеток с облученным К562 CL9 mIL21 (1:1) в NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3).

Дни 17 и 19

2. Подсчитайте количество клеток.
3. Изменение СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3).

День 21

4. По истечении трех недель расширения подсчета количества клеток в культуре.
5. Восстановление 1x10 ⁶ клеток для анализа потока цитометрии для полного ячейки NK панели антител фенотипирование (см. Таблицу 1).
6. Замораживание клеток в ФБС, содержащий 10% ДМСО при максимальной плотностью 5х10 ^{7 клеток} на флакон для будущего использования.

3. Н. К. сотовый Цитотоксичность Пробирной

1. Оттепель флакон НК-клеток и семян NKEM, за день до ЧПrforming цитотоксичность анализа, чтобы восстановление.
2. Для каждого НК анализа цитотоксичности клеток с использованием одной линии клеток-мишеней, 6x10 ⁵ NK клеток и 3х10 ⁵ клеток-мишеней не требуется (см. примечание 5).
3. Подготовка CAM-Медиа путем разбавления кальцеин-AM (акции 1 мг / мл в ДМСО) в NKEM (См. примечание 6).
4. Ресуспендируют 10 ⁶ клетки-мишени в 1 мл CAM-медиа (см. Примечание 7).
5. Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C, при периодическом встряхивании.
6. Ресуспендируют NK клеток на 1x10 ^{6 клеток} / мл и добавить 200uL НК клеточной суспензии для каждого из 3 скважин U-дно 96-луночного планшета соответствующие до 10: 1 E: T соотношение показано на рисунке 1. (См. Примечание 8)
7. Добавить 100 мкл полной СМИ, чтобы все оставшиеся лунки за исключением "Максимум".
8. Добавить 100 мкл 2% Тритон Х-100 на "Максимум".
9. Выполните серийные разведения NK клеток для последующей 5 E: T отношений путем передачи 100 мкл клеток каждый раз, хорошо перемешать. Отменить 100 мкл из последних скважин (E: T отношение 0.3125:1).
10. Через 1 час загрузки кальцеин, мыть клетки-мишени в NKEM дважды, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. (См. Примечание 9)
11. Пересчет клеток-мишеней и ресуспендируют в 1х10 ^{5 клеток} / мл.
12. Добавить 100 мкл клеток-мишеней в каждую лунку (1x10 ⁴ / а). Центрифуга в течение 1 мин на 100 г инициировать ячейки контакта.
13. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 4 часов.
14. Смешайте культуры осторожно с помощью пипетки с 100 мкл pipetter для того, чтобы равномерно приостановить выпущен кальцеин, замедления вращения пластины на 100 г в течение 5 минут для осаждения клеток и передачи 100 мкл надосадочной к новой пластинкой заботясь, чтобы избежать пузырей. Поп пузыри, которые могут форму с помощью тонкой иглы.
15. Прочитано пластины с использованием флуоресцентных читателя пластины (возбуждение фильтра 485 нм, эмиссия фильтр 530 нм). Нижняя читать рекомендуется.
16. Рассчитать процент Конкретные Лизис по формуле [(тестовый релиз-спонтанное выделение) / (максимальное релиз - спонтанное выделение)] х 100.

4. Н. К. сотовый Очистка RosetteSep

1. Возьмите 100-кратного избытка эритроцитов, что и МНПК или расширенных клеток, в 50 мл трубки (100:1 РБК: МКПК).
2. Если вы используете свежие эритроциты приступить непосредственно к следующему шагу, или если эритроциты хранились в растворе Alsever с, подсчитать количество эритроцитов и промыть соответствующий (100-кратного избытка) количество эритроцитов с PBS с добавлением 2% ЭТС три раза, центрифугирования при 1200 оборотов в минуту в течение 10 минут каждый раз.
3. Комбинат эритроцитов с МНПК с шагом 1,7 или расширенных клетки шагом 2,10 в PBS + 2% ЭТС для конечного объема 1 мл на 5x10 ⁷ из МНПК или расширенных клеток.
4. Добавить 1 мкл из RosetteSep  человеческих клеток NK обогащению Коктейль на 1x10 ⁶ из МНПК или расширенных клеток.
5. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут с нежным смешивания каждые 5 минут.
6. Добавить равным объемом PBS + 2% смеси FBS мягко и слой поверх Ficoll-Paque.
7. Повторите шаги Ficoll-Paque центрифугирования описано для изоляции РВМС (раздел I).
8. Граф Н. К. клетки восстановились после очистки и отложите 5x105 клеток для phenotpying методом проточной цитометрии для НК ячейки чистоты (Шаг 8).

5. Примечания

ПРИМЕЧАНИЕ 1. НК-клеток может быть расширен непосредственно из МНПК, или от RosetteSep  очищенной NK клеток. Мы отметили, аналогичные эффективность расширения, но некоторые доноры могут иметь очень низкие НК номера сотовых в результате чего трудности очистки от RosetteSep до расширения.

ПРИМЕЧАНИЕ 2. Мы обычно используют CD56-FITC, CD16-PE и CD3-PE-Cy5 для фенотипирование в ходе расширения, перечисляя НК-клеток, как те, которые CD3-отрицательных и CD16-CD56 или-положительными.

ПРИМЕЧАНИЕ 3. При каждом изменении СМИ или стимуляции, ресуспендирования клеток в 2,5 х 10 ⁵ / мл держать РВМС / NK на номера сотовых или менее 2 миллионов на мл на пике стадии расширения. Это позволит предотвратить истощение питательных веществ и помочь в достижении максимального расширения и выживания.

Примечание 4. НК скорость расширения доноров зависимых и в конце стимуляции 1 или 2 части клетки могут быть заморожены, а часть еще больше расширить в зависимости от экспериментальных нужно. У нас были хорошие успехи в использовании замороженных клеток для разложения на более позднее время.

ПРИМЕЧАНИЕ 5. В целях обеспечения права на ошибку мы рекомендуем использовать не менее 7х10 ⁵ NK клетки ресуспендировали в 700 ULS из NKEM и 4x10 ⁵ кальцеин-АМ окрашенные клетки-мишени ресуспендировали в 4 мл NKEM для создания цитотоксичность анализа. При использовании многоканальной пипетки для посева клеток-мишеней больших объемов ячеек (до 6x10 ⁵ в 6 мл) могут потребоваться в зависимости от размера средств массовой информации бассейна используется. Также рекомендуется НК номера сотовых специально для E: T отношения шоу в протокол, для использования более высоких E: T соотношение увеличенияНК номера сотовых на мл соответственно (например, для 40:1 E: T соотношение использования 4x10 ^{6 клеток} / мл)

ПРИМЕЧАНИЕ 6. Рекомендуется выполнять предварительные кальцеин-АМ загрузки титрования для линии клеток-мишеней выбора, используя следующие разведения 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 и 1:100 для достижения оптимальной разницу между максимальной и спонтанное освобождение.

ПРИМЕЧАНИЕ 7. При использовании приверженцем клеточной линии, как цель, сначала подготовить суспензии отдельных клеток с использованием не-ферментативной клеточной диссоциации буфера. При выполнении ADCC, готовят дубликаты трубки клеток-мишеней в CAM-медиа.

ПРИМЕЧАНИЕ 8 При выполнении ADCC, добавить же NK клетки 3 скважины соответствующей 10:01 E:. Т для ADCC. Повторите эти действия для дополнительных доноров. Повторите эти действия для дополнительных клеток-мишеней.

Примечание 9. При выполнении ADCC эксперимента, после 45 минут загрузки кальцеин, добавьте 10ug из антител, специфичных для стимулирования ADCC против клеток-мишеней. После 15 минут, промойте клетки-мишени в полной среде в два раза, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. Ресуспендируют клеток 1х10 ^{5 клеток} / мл и приступить к следующему шагу в протокол.

6. ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ

Рисунок 2. Когда расширение выполняется согласно схеме, описанной выше, с использованием 5x106 МНПК в качестве исходного материала, типичные НК клетка дает диапазон от 1x10 ⁹ до ¹⁰ 10 клетки (донора зависимыми изменчивость). На рисунке показана НК ячейки раза расширения (п = 19) по сравнению с НК клетки, присутствующие в оригинальный продукт (средний + / - квартиль).

Рисунок 3. Расширены клетки NK выражения различных NK-клеточных рецепторов, которые сопоставимы с невспененные первичной NK клеток с несколькими исключениями (CD11b, CD160 и CD244).

Рисунок 4. МНПК восстановление после Баффи пальто доноров зависимым и может варьироваться от ⁶ до 300x10 800x10 ^6. NK клетки могут включать в себя 2% - 18% МНПК. Для очистки RosetteSep расширенного клеток, восстановления чистых натуральных киллеров на 14 день составляет от 40-70%. Следуя рекомендуется протокол расширения и очистки, Н. К. чистоты ячейка 99% можно ожидать.

Рисунок 5. Расширенное НК-клеток показали, цитотоксичности против ряда опухолевых клеточных линий, включая нейробластома, борьбы с отмыванием денег, остеосаркома и меланома (представительных AML убийство показано в процентах конкретных лизис).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
	Антитело	Тома на тест	Компания	Номер в каталоге
Труба 1	Изотип FITC Изотип FITC Изотип FITC Изотип FITC FACS буфера Общий объем	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	555748 555749 557224 340442
Tube 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS буфера Общий объем	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
Труба 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS буфера Общий объем	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen R & D Systems Miltenyi Biotec R & D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
Труба 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS буфера Общий объем	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 555388 555341 558664
Труба 5	CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS буфера Общий объем	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
Труба 6	CD56 FITC CD244 (2В4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS буфера Общий объем	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42