Точное мышиной моделью острого повреждения почек (АКИ) в связи с ишемией является важным инструментом для исследования острого повреждения почек и, возможно, найти терапевтических средств для лечения почечных повреждений. Висит вес система предлагает инструмент для немедленного и надежного почечной окклюзии артерии и реперфузии, не вызывая почечную заторов.
Методическая статья
Использование Висячие вес системы для изолированного почечной артерии Окклюзия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
У госпитализированных пациентов более 50% случаев острого повреждения почек (ОПП) вызваны ишемией почек 1-3. Недавнее исследование госпитализированных пациентов показало, что даже незначительное повышение уровня креатинина в сыворотке крови (от 0,3 до 0,4 mg/dl) связано с увеличением риска смерти на 70% по сравнению с пациентами без такого повышения 1. В связи с этим хирургические операции, требующие пережатия аорты и почечных сосудов, сопровождаются частотой развития почечной недостаточности до 30% 4. Аналогичным образом ОПП после кардиохирургических операций в обычных условиях возникает более чем у 10% пациентов и сопровождается резким ростом смертности. ОПП также является частым осложнением после трансплантации печени; по крайней мере у 8–17% пациентов возникает необходимость в заместительной почечной терапии 5. Кроме того, отсроченная функция трансплантата из-за повреждения клеток канальцев при трансплантации почки часто связана с ишемическим ОПП 6. Также ОПП развивается примерно у 20% пациентов, страдающих сепсисом 6. Развитие ОПП связано с резким увеличением показателей заболеваемости и смертности 1. Терапевтические подходы крайне ограничены, и большинство интервенционных исследований ОПП на людях не дали результатов. Следовательно, существует острая необходимость в дополнительных терапевтических методах предотвращения повреждения почек вследствие ишемии 3, 7-9.
Для выяснения механизмов повреждения почек вследствие ишемии и возможных терапевтических стратегий интенсивно требуются мышиные модели 7-13. Модели на мышах позволяют использовать различные генетические линии, включая генно-модифицированных мышей и мышей с тканеспецифичным нокаутом генов (система cre-flox). Однако моделирование ишемии почек у мышей технически сложно, и детали проведения эксперимента существенно влияют на результаты. Мы провели систематическую оценку новой модели изолированной окклюзии почечной артерии у мышей, которая специально исключает использование зажимов или наложения швов на почечный пучок 14. Данная модель требует нефрэктомии правой почки, так как из-за особенностей экспериментальной установки ишемия может быть проведена только в одной почке. Фактически, при использовании системы с подвесным грузом манипуляции с почечной артерией проводятся всего один раз за всю хирургическую процедуру. Кроме того, при использовании данной методики не возникает венозной или уретральной обструкции. Измеряя уровень креатинина в сыворотке крови, мы смогли продемонстрировать зависимое от времени и дозы, а также высоковоспроизводимое повреждение почек при ишемии. Более того, при сравнении этой новой модели с традиционным зажимом всего почечного пучка нефропротекция путем ишемического прекондиционирования оказывается более выраженной и надежной. Таким образом, эта новая методика может быть полезна другим исследователям, работающим в области острого повреждения почек.
Протокол
Общие замечания. Все операции должны проводиться в вертикальном рассекает микроскопа (Leica) и с помощью хирургического коагулятора. Мышей в экспериментальных групп должны соответствовать по возрасту и весу для обеспечения сопоставимости результатов. Температура, давление крови, анестезии и жидкости администрации должны быть стабильными и контроля в ходе эксперимента.
1. Анестезия и хирургия
- Почечная экспериментов ишемии может быть выполнена с применением одновременно ишемии и реперфузии в обеих почках, или после одной почки в сочетании с ишемией лечения оставшуюся почку. Как двусторонние лечения ишемии обеих почек связано с увеличением технических трудностей, более сложные экспериментальные установки и больше хирургии, мы будем выполнять правой почки следует ишемии лечение оставшихся левой почки, используя подвесной системы весов. Мы использовали эту висит вес системы и для окклюзии коронарных артерий сердца. Тем не менее, процедура отличается так почечной артерии может быть изолирован от окружающих тканей, тогда как коронарная артерия лежит в сердечной мышце.
- Мыши (8-14 недельного возраста, любого пола) будут под наркозом с фенобарбиталом в дозе 70mg/kg. Мы будем поддерживать анестезии с ок. 10 мг / кг / ч натрия фенобарбитала. Передозировка может значительно снизить артериальное давление и таким образом могут изменить результаты. В наших первоначальных исследований мы также использовали кетамин и ксилазина. Однако эти соединения индуцированные сильным брадикардия (150 об / мин). Кроме наблюдается брадикардия есть также доказательства того, что оба соединения участвуют в защитных механизмов в процессе условиях ишемии. Летучие анестетики не может быть использована либо из-за их способности вызывать почечную также защита и низкое кровяное давление. Поэтому наш окончательный выбор для анестезии фенобарбиталом. Кроме того, кетамин и ксилазина в основном выводится почками. Нефрэктомия и ишемии может продлить кетамин анестезии.
- Как только боль рефлексы отсутствуют (испытания, сжимая пальцами с помощью пинцета) мыши будет размещен на регулируемой температурой нагрева таблицы (РТ, Effenberg, Мюнхен, Германия для поддержания температуры тела на 37,0 ° С) в левой боковой позиции пролежни.
- Прикрепите нижние и верхние конечности к столу с помощью ленты.
- Для не-выживания операции, такие, как показано на видео-демонстрации, крышка области разреза с минеральным маслом, чтобы предотвратить вдыхание мыши волос, сокращая кожу и тем самым предотвратить риск аллергии мыши волос. В случае выживания экспериментов соответствующих асептических методов, включая обрезание волос, лечение кожи с йодофоры (например, Бетадин), стерильная обработка автоклавного инструментов и использование масок стерильные перчатки для хирурга, обязательны для заполнения. Минеральное масло не используется в выживании операций. Для выживания операции стерильным NaCl используется
- Правый фланг разрез будет выполнен с ножницами и коагуляции электрод (Эрбе, ICC50, Германия), чтобы предотвратить кровотечение из мышц и сосудов кожи. В отличие от доступа через почки средней линии лапаротомии, этот метод не требует доступа к брюшной полости.
- Почечной ножки в том числе почечной артерии и почечной вены лигируют использованием 4 / 0 шелковых шва и правой почки будут сокращены с ножницами, не мешая надпочечников судов.
- Хирургические раны закрывают непрерывным швом (два шва) стены мышц и кожи с 4 / 0 шва.
- Животных помещали в правой боковой позиции пролежни и левого фланга разрез будет выполнен.
- Левой почки тщательно удалены из соединительной ткани, избегая надпочечников и сосудов.
- Далее, почки обратился с его вентральной стороной вниз в чашку плексигласа. Плексигласа чашки должны быть стерилизованы за выживание операций. Полюс почки аккуратно продвигают в плексигласа чашку, держа в окружающие ткани с щипцами. После этого полюса аккуратно продвигают в плексигласа чашка с щипцами. Почки будут поддерживаться во влажном состоянии и теплый с мокрым тампоном, пропитанный водой на 37,0 ° C.
- После воздействия на левую почку и размещение в плексигласа чашку почек держатель сдерживается вентрально, чтобы напряжение на почечные сосуды. Достаточным сдерживающим имеет важное значение для успешного размещения шва при почечной артерии. После этого держатель почек является фиксированной и почечной артерии можно легко определить, как она работает поверх почечной вены.
- Почечной артерии рассечена от прилегающих тканей, недалеко от его взлета из брюшной аорты с мелкими щипцами. Артерия расчлененный от основной вены с изогнутым пинцетом на самом верху.
- 8 / 0 шелк для наложения швов (Ethicon, Нордерштедт, Германия) находится под почечной артерии с помощьюодин пинцет в качестве ведущего руководства. Эта техника позволяет прерывания только артериального притока крови к почке без сжатия почечной вены, по сравнению с зажим почечной ножки.
- Шва находится над небольшой полюс (может быть подготовлено булавку) и вес ок. 1g прилагается к каждому концу (Eppendorf трубки). Вес может быть адаптирована к почке размер путем получения или добавления воды в трубах Эппендорф. Тем не менее, артерии должен быть слегка потянул вверх, так что ни крови, проходящей через артерии, но без серьезных растянуть на артерии. Основные стресс растянуть на артерии может привести к повреждению стенки сосуда с утолщением стенки артерий и снижению реперфузии.
- Хотя вес не поддерживаются, почечной артерии сразу окклюзии. Напротив, когда вес поддерживаются, поток крови сразу же становится доступным для органа. Успешное окклюзии подтверждается изменением цвета от красного до белого.
- Разные эпохи ишемии может быть выполнена в соответствии с требованиями эксперимента. Полной реперфузии пройдет в зависимости от продолжительности ишемии времени. Ишемия раза до 45 минут, позволяют извлекаемые травмы почек. В наших экспериментальных условиях мы использовали 20 до 30 минут ишемии со средним поражение почек, которое позволяет нам увидеть улучшения, а также нарушения функции почек в зависимости от штамма мыши и лечения.
- После полной реперфузии почки может быть заменен из плексигласа чашку. Поэтому почки держатель незаписанных и напряженности на почки не будет отпущена. Черепной полюс мягко удалены из чашки с мягким пинцетом и хвостового полюса сразу следует.
- Фиксации (ленты) из мыши может быть освобожден и мыши могут быть помещены в лежачем положении, например, для FITC-меченого инулин оформление.
- В подмножеств экспериментов, артериального давления и частоты сердечных сокращений могут быть записаны всей хирургической процедуры. Измерения артериального давления получаются непрерывно через сонную артерию катетер. Короче говоря, сонная артерия подвергается помощью тупого рассечения паратрахеальных мышц. После дальнейшего воздействия и тщательного избежании ткани травмы (особенно из блуждающего нерва), катетер вводится в сосуд с помощью двух швов и небольшой зажим. Артериальное давление измеряется элемент Стэтхэм (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Швейцария).
- Для FITC-меченого клиренсом инулина катетер должен быть размещен в левой яремной вены для инфузий хлорида натрия и FITC-меченого инулин. Кроме того мочевой пузырь катетер должен быть вставлен для сбора мочи в моде зависит от времени, как описано ниже в деталях.
2. Измерение почки
- В общем: следующие параметры результата рекомендуется определить почки следующие ишемии почек:
Выполните FITC-меченого инулин оформление для оценки скорости клубочковой фильтрации (СКФ). В качестве альтернативы определить клиренс креатинина и сывороточного креатинина через метаболические расследования клетке 24 часов после повреждения почек. Выполните почечной H & E окрашивания и миелопероксидазы (МПО) ИФА для определения почечного повреждения и воспаления 24 часов после ишемии почек. - Метаболические исследования клетки:
- После ишемии левой почки снова включается в забрюшинном положении и рана закрыта, как описано выше.
- В конце операции мышей получают 0,3 мл физиологического раствора IP и восстанавливаться в течение 2 часов при нагреве лампы.
- После этого мышей будут помещены в метаболические клетки (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Германия) для определения функционального почечного параметры 2 раза в 24 часа.
- Забор воды из каждой мыши должен быть определен путем взвешивания пустых и заполненных бутылку с водой перед подачей в мышь и чем через 24 часа путем взвешивания полную бутылку снова. Вес мыши должна быть определена, а также.
- После 24 часов примерно 75μl крови взяты из венозного сплетения позади глаз через капилляр под кратковременным наркозом isoflorane.
- Функция почек оценивается путем измерения плазмы и мочи, креатинин 24 часов после ишемии почек использованием коммерчески доступных colorimtric метод по словам производителя `ы протокол (LT-SYS, труда + Technik, Берлин, Германия). Плазме и моче концентрации Na +, K + определяются с огненно-излучения фотометр (ELEX 6361, Eppendorf AG, Гамбург, Германия). Почечная выделительная и гемодинамические значения рассчитываются по стандартным формулам 15-17.
- Инулин просвет: FITC-инулин экспериментов оформление будет производиться следующим ишемии почек.
- Левой яремной вены канюлированные для непрерывного яnfusion. После вскрытия вен от соседних тканей с подготовкой ножницами (Дюмон, WPI) за два швов (4 / 0) вокруг вены. Место зажим на вену до proximale шва, чтобы остановить поток крови. После закрытия дистальной узел и место вес на одну из дистальных концах шва напрягаться напряженности на вены. Это очень важно, чтобы катетер в вену. Использование микро-ножницами резать небольшое отверстие в вену. Держите открытия с прекрасно щипцы (Дюмон, WPI) и поместить катетер в вену. Для продвижения катетера принять зажим прочь. Убедитесь, что нет напряжения на катетер, так что вы можете разместить его без его проведения. После закрытия второго проксимальный шов на вены и катетера.
- Катетер в мочевой пузырь для сбора мочи своевременным. Поэтому вы режете короткий разрез кожи над мочевым пузырем. Осторожно снимите мочевого пузыря через кожу отверстие. Fix мочевого пузыря с мокрой ткани. Место подготовлено шва над мочевым пузырем (4 / 0).
- Вырезать небольшой фрагмент катетера (1,5 см) и тепла на конце, чтобы получить кольцо вокруг катетера, что делает его легче исправить ее в мочевой пузырь.
- Вырезать отверстие в мочевом пузыре на самом верху. Сделайте разрез между судами, чтобы предотвратить кровотечение. Вставьте большой конце катетера в мочевой пузырь и закрыть шов более катетера и мочевого пузыря.
- Все мыши, получать болюс 0,85% раствор хлорида натрия в сумме, равной 20% массы тела. Непрерывная инфузия поддерживается на скорости 800ul/h/25g массы тела и FITC-инулин добавляют настой для оценки целого почек скорости клубочковой фильтрации (СКФ). После стабилизации животных в течение 20 мин, 20 мин коллекции приурочен мочи выполняются (четыре раза) для определения скорости потока мочи и FITC-инулин. Кровь, полученные в середине каждого периода для измерения FITC-инулин.
- При запуске коллекции периоды в течение 20 минут использования таймера. Сбор мочи путем размещения конце катетера в мочевой пузырь трубочку Эппендорф. Измерить вес трубки до и после сбора мочи, так что вы можете определить, мочи сумму. Пробы крови взяты через retroorbital формы для сбора крови венозного сплетения через капилляры в середине каждого периода сбора.
- Кровь и почки можно собирать после каждой процедуры для дальнейшего анализа, например, МПО ИФА, цитокинов EISA, гистологии.
3. Представитель Результаты:
Рисунок 1 Модель висит вес системы ишемии почек. Повешение веса была создана система, чтобы вызвать почечную ишемию левой почки. Поэтому 8,0 нейлона шов был помещен под почечной артерии, а в конце каждого шва малый вес (1 г) была прикреплена. Этот экспериментальный дизайн позволяет обратимо окклюзии почечной артерии, применяя и выпуская вес груза.
Обсуждение
Таким образом, настоящее исследование описывает новый метод для выполнения ишемии почек в мышиной модели с использованием подвесной-весовой системы для почечной окклюзии артерии. По сути, это исследование показывает, высокой воспроизводимостью травмы, таким образом минимизируя изменчивость связана с зажим почечной ножки.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Настоящего исследования были поддержаны США Национальных Институтов Здоровья грант R01-HL092188, R01-DK083385 и R01HL098294 и фонда образования Анестезия и исследований (FAER) Гранты HKE, FAER предоставить JYD и DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Научные исследования стипендий (GR2121/1-1) для AG.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| Натрий пентобарбитал | Vortech Фармацевтическая Ls, ООО | VPL 9372 | 4mg/mL в физиологическом растворе |
| Шовный, шелк 4,0 | Гарвардский аппарата | 517698 | |
| Шовный, Prolene 8,0 | Ethicon, США | M8739 | многоразовый |
| препаровальная лупа | Leica | н / | рассмотреть щедрые рабочее расстояние |
| Отопление таблице | Rt, Effenberger, Германия | н / | только и одного поставщика |
| Хирургические инструменты | WPI, Дюмон | штрафа ножницеобразный микрососудов |
Ссылки
- Abuelo, J. G. Normotensive ischemic acute renal failure. N Engl J Med. 357, 797-805 (2007).
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 448-460 (1996).
- Lameire, N. The pathophysiology of acute renal failure. Crit Care Clin. 21, 197-210 (2005).
- Gelman, S. The pathophysiology of aortic cross-clamping and unclamping. Anesthesiology. 82, 1026-1060 (1995).
- Yalavarthy, R., Edelstein, C. L., Teitelbaum, I. Acute renal failure and chronic kidney disease following liver transplantation. Hemodial Int. 11, Suppl 3. S7-S12 (2007).
- Schrier, R. W., Wang, W. Acute renal failure and sepsis. N Engl J Med. 351, 159-169 (2004).
- Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T. The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia. PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).
- Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M. Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).
- Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T. Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia. J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).
- Akcay, A., Nguyen, Q., Edelstein, C. L. Mediators of inflammation in acute kidney injury. Mediators Inflamm. , 137072-137072 (2009).
- Faubel, S., Ljubanovic, D., Poole, B. Peripheral CD4 T-cell depletion is not sufficient to prevent ischemic acute renal failure. Transplantation. 80, 643-649 (2005).
- Wei, Q., Bhatt, K., He, H. Z., Mi, Q. S., Haase, V. H., Dong, Z. Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 21, 756-761 (2010).
- Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors. Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).
- Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).
- Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).
Перепечатки и разрешения
