$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка донорских тканей
- Подготовка питательных сред, резкость стекла булавки, резкость вольфрамовой иглы.
- Сбор эмбриона из оболочки, промыть в ледяной PBS.
- Использование 10 мл шприц и иглу 18 калибра удалить 1,0 мл альбумина с заостренным концом из яичной скорлупы.
- Сделайте небольшое отверстие на верхней части корпуса использованием точки ножницами, а затем вырезать круглое отверстие подвергать эмбрион
- Удалите головы и поместить в DMEM (без сыворотки, комнатная температура)
- Рассеките лобно-носовой процесса от эмбриона (или другой сайт доноров, таких как верхнечелюстной или нижней челюсти процесс)
- Дайджест в 2.4U / мл dispase в ФСБ на льду в течение 20 минут
- Обложка тканей с DMEM с 1% BSA, чтобы остановить пищеварения
- Используйте заостренные вольфрамовой иглы для разделения эктодермы, мезенхимы и нейроэктодермы
- Магазин трансплантата ткани в DMEM 1% BSA на льду, пока хозяин готов к трансплантации
2. Подготовка хоста
- Expose эмбриона
- Использование 10 мл шприц и иглу 18 калибра удалить 1,0 мл альбумина с заостренным концом из яичной скорлупы.
- Сделайте небольшое отверстие на верхней части корпуса использованием точки ножниц. Место кусок ленты через отверстия, а затем вырезать круглое отверстие подвергать эмбрион.
- Использование 2 пары щипцов, держитесь амнион и мягко слезу, чтобы сделать отверстие.
- Поворот головы, поставив пару щипцов на правый глаз и применении давления. Удерживая голову неподвижно, использование вольфрамовой иглы для удаления хоста эктодермы для размещения трансплантата.
- Передача трансплантата для хоста с помощью стеклянной пипетки.
- Позиция трансплантата для замены удалены эктодермы. Вставьте стекло штифт в каждом углу пересаженной ткани к контакту трансплантата на месте. Для того, чтобы стекла булавки, тянуть микрокапиллярных трубки в виде штрафа в точку над алкоголем пламени.
- Место лента плотно над отверстием и вернуть эмбрион инкубатор для соответствующего периода времени для анализа.
- см. также: 9
3. Представитель Результаты:
Для оценки химер, эмбрионы должны быть собраны и обработаны для анализа распределения принимающих и донорских тканей. Для обнаружения перепелиные клетки, иммуногистохимия использованием антител QcPN (описано в: 3) работает, и для обнаружения клеток мыши, в гибридизация на парафиновых срезах используется 6. Донорские клетки должны быть ограничены эпителия, и не должно быть никаких признаков донорских тканей мезенхимальные (рис. 1). Наличие изолированных клеток донора в мезенхимы указывает на наличие загрязнения нервных клеток гребню, который будет смешивать любые морфологические интерпретации из-за влияния этих клеток по многим аспектам лица развития (например, 10). Убедившись, что трансплантат техника свободна от загрязняющих мезенхимы, дальнейшие морфологические и молекулярные критерии оценки могут быть использованы для оценки химер. Для наших целей, мы обнаружили наличие внематочной хрящей и костей, которые соответствовали дублирования верхней челюсти, которые были вызваны пересаженных тканей (рис. 2), и молекулярные изменения в мезенхимальной ткани в ответ на привитых эктодермы (рис. 3) 5,6.
Рисунок 1. Оценка химеризма () Анти-QcPN окрашивания используется для обнаружения клеток перепела перепела-цыпленок химеры. Существует никаких доказательств окрашивания в мезенхимы. (Б) В гибридизация используется для обнаружения выражение стенограммы SINE B2 в мыши куриных химеры. Выражение ограничивается эктодермы включает трансплантата.
Рисунок 2. Trichrome окрашивания показывает дублирования верхней челюсти в скелет () перепел-цыпленок химера, и (Б) мыши-химеры цыпленок.
Рисунок 3. Эктодермы regultes экспрессии генов в мезенхимы. (А) Обычная BMP7 выражение в мезенхимы из куриного эмбриона (радиоактивные на месте гибридизации с позитивным сигналом псевдо-красного цвета в Adobe Photoshop). (B) BMP7 экспрессия индуцируется в мезенхимы, прилегающих к трансплантата (Стрелка) в химерных эмбрионов.