Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика

Summary

Этот протокол описывает метод в режиме реального времени измерения потоков митохондриального кальция флуоресцентные изображения. Метод использует циркулярно permutated YFP основе двойного возбуждения логометрических кальция датчика (логометрических pericam-м) выборочно выражается в митохондриях.

Abstract

Динамические изменения внутриклеточной концентрации кальция в ответ на различные стимулы регулируют многие клеточные процессы, такие как пролиферация, дифференцировка и апоптоз¹. Во время апоптоза накопление кальция в митохондриях способствует высвобождению проапоптотических факторов из митохондрий в цитозоль². Поэтому представляет интерес прямое измерение митохондриального кальция в живых клетках in situ во время апоптоза. Доказано, что флуоресцентная визуализация высокого разрешения клеток, загруженных ратиометрическими и нетатометрическими синтетическими индикаторными красителями кальция с двойным возбуждением, является надежным и универсальным инструментом для изучения различных аспектов внутриклеточной передачи сигналов кальция. Измерение цитозольных потоков кальция с помощью этих методов относительно просто. Тем не менее, измерение уровня внутримитохондриального кальция в интактных клетках с использованием синтетических индикаторов кальция, таких как rhod-2 и rhod-FF, является более сложной задачей. Синтетические индикаторы, нацеленные на митохондрии, притупляют реакцию на повторяющееся увеличение митохондриального кальция и нарушают морфологию митохондрий³. Кроме того, синтетические индикаторы имеют тенденцию утекать из митохондрий в течение нескольких часов, что делает их непригодными для долгосрочных экспериментов. Таким образом, генетически кодируемые показатели кальция, основанные на зеленом флуоресцентном белке (GFP)⁴ или экворине⁵, нацеленном на митохондрии, значительно облегчили измерение динамики митохондриального кальция. В этой статье мы опишем простой метод измерения потоков митохондриального кальция в режиме реального времени в ответ на различные стимулы. Метод основан на флуоресцентной микроскопии «ратиометрического перикама», который избирательно воздействует на митохондрии. Ратиометрический перикам представляет собой индикатор кальция, основанный на слиянии кольцево переставленного желтого флуоресцентного белка и кальмодулина⁴. Связывание кальция с ратиометрическим перикамом приводит к смещению пика его возбуждения с 415 нм до 494 нм, в то время как спектр излучения, достигающий пика около 515 нм, остается неизменным. Ратиометрический перикам связывает одиночный ион кальция с константой диссоциации in vitro ~1,7 мкМ⁴. Эти свойства ратиометрического перикама позволяют количественно оценить быстрые и долгосрочные изменения концентрации кальция в митохондриях. Кроме того, мы описываем адаптацию данной методики к стандартному широкопольному кальциевому микроскопу с общедоступными наборами фильтров. Используя два различных агониста, пуринергический агонист АТФ и индуцирующий апоптоз препарат ставроспорин, мы демонстрируем, что этот метод подходит для мониторинга изменений концентрации кальция в митохондриях с временным разрешением от нескольких секунд до нескольких часов. Кроме того, мы также показываем, что ратиометрический перикам также полезен для измерения деления/фрагментации митохондрий во время апоптоза. Таким образом, ратиометрический перикам особенно хорошо подходит для непрерывного долгосрочного измерения динамики митохондриального кальция во время апоптоза.

Protocol

1. Pericam-т Трансфекция и клеточной подготовка.

1. Пластина HeLa клетки ночь перед трансфекции на стерильные покровные стекла, помещаемых в стандартной 6-и культуру пластину.
2. Подготовка ДНК / Lipofectamine 2000 комплексов в соответствии с предложением производителя (Invitrogen). Мы используем 4 мкг логометрических-pericam-т вектор экспрессии и 10 мкл Lipofectamine 2000 разводят в 0,5 мл Opti-MEM для каждой скважины. Камеры должны быть ~ 70% сливной до трансфекции.
3. Замените HeLa питательных сред (Дульбеко изменение орлы среды, 10% FBS, пенициллин / стрептомицин) в каждую лунку с 1,5 мл того же средства массовой информации без антибиотиков.
4. Добавить ДНК / Lipofectamine комплексов в каждую лунку для трансфекции. Осторожно перемешать с качалки и инкубировать в течение 4 часов в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ^° С, 5% СО _2.
5. Замените антибиотикам свободных средств массовой информации с питательной среды с помощью антибиотиков. Разрешить клетки, чтобы выразить логометрических pericam за 1-2 дня до съемки.

2. Установка микроскопа и Image Acquisition

1. Место покровное с клетками HeLa в соответствующие камеры изображения с решением изображений: 107 мм NaCl, 7,2 KCl, 1,2 мм MgCl _2, 1 мМ CaCl _2, 11,5 мм глюкозы, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 20 мМ HEPES 7.2. Наша лаборатория использует камеру Attofluor клетку от Invitrogen. Горы изображения камеры в перевернутый столик микроскопа.
2. Найти область интересов, содержащие один или несколько клеток, экспрессирующих логометрических pericam использовании 40x (или выше) нефти погружения цели. Мы обнаружили, что логометрических pericam менее устойчив к фотообесцвечивания при 380 нм, и, таким образом мы используем эту длину волны для определения подходящих клеток. Для изображений, полученных на рисунке 1, Nikon Superfluor 40X объектива с числовой апертурой 1,3 был использован. Высшие цели увеличения бы также целесообразным (60-100x). Возбуждение фильтры были использованы технологии Chroma фильтры D380/30x (380 + / - 30 нм) и D495/10 (495 + / - 5 нм), светоделитель был 505DCXR (505nm longpass), а также выбросов фильтр HQ535/50m (535 + / - 25nm).
   Наш микроскоп используется для получения изображения на рисунке 1, состоит из Nikon TE2000 инвертированный микроскоп оснащен Ропер Научная Coolsnap HQ охлаждением ПЗС-камера, Ludl MAC6000 быстрого фильтра колесо и чейнджер, и приобретение MetaFluor данных и анализа программного обеспечения. Этот протокол может быть адаптирована к любым стандартным широким полем микроскоп с соответствующими фильтрами и программного обеспечения, способного захвата и обработки логометрических изображений.
3. Настройка программного обеспечения для использования двойного возбуждения 495 и 380 нм фильтра. Кальций привязки к логометрических pericam увеличивает абсорбцию при 495 нм, что коэффициент должен быть создан к 495 nm/380 нм.
   Логометрический pericam имеет бескальциевой пика возбуждения при 415 нм ^4. В этом протоколе мы предлагаем использовать 380 нм фильтра только потому, что повсеместно в большинстве лабораторий кальция изображений. Если 410 нм фильтра доступна, то предпочтительнее фильтр 380 нм.
4. Получение изображений последовательно альтернативно захватывающей на 495 и 380 нм. Получение изображений из базовых уровней кальция, по крайней мере 30 секунд до применения агонистов через перфузии аппарата. Марк того времени для каждого агониста. Выдержки раз и приобретение интервалы должны быть оптимизированы, чтобы предотвратить фотообесцвечивания в то же время обеспечивают достаточное временное например resolution.For, для полу-быстрому кальция динамики мониторинг в ответ на стимуляцию агонистами, изображения были приобретены через каждые две секунды на рисунках 1В и С. Гораздо быстрее ставки приобретения Возможны также ^6. Долгосрочные изображений после стауроспорин администрации был приобретен с более длительным интервалом (30) между приобретений (рис. 1 D и Е).

3. Обработки и анализа изображений

1. Как только эксперимент завершен, полученные изображения можно анализировать в автономном режиме. Определить регионы интереса (ROI), в которой вы хотите отслеживать изменения в уровни кальция. Используйте ROI выбран в пустую область поля вычесть фон, если это необходимо. Следует отметить, что митохондрии являются весьма подвижны и динамичны, и экстраполировать события в одной митохондрии в течение длительного периода не всегда возможно. Таким образом, учитывая высокую подвижность этой органеллы в некоторых типах клеток, выбор ROI должны быть тщательно проверены. Кроме того, о чем свидетельствует на рисунке 1, митохондрии ответ гетерогенно на различные раздражители. Поэтому очень важно для анализа данных в автономном режиме и контролировать RO1 размещения на кадр за кадром. Подробное описание измерения митохондриального кальция в сильно подвижных митохондрии была описана в другом месте ^7.
2. Полученный коэффициент измерений ROI могут быть импортированы в Excel или аналогичные graphingsoftware. Данные могут быть представлены в виде следов представляющего изменений в митохондриальной уровня кальция в одной ячейке или отдельные митохондрии, или усредненные этuorescence сигналы от нескольких ROI. Мы также использовали эту технику для измерения средней митохондриальные уровни кальция в популяции лимфоцитов проходит апоптоз, вызванный Fas лиганд ^8.

4. Представитель Результаты:

Рисунок 1. (А) субклеточных локализации логометрических-pericam-т. Это первое изображение показывает живой клетки HeLa выражения логометрических-pericam-т. Второе изображение показывает флуоресцентного окрашивания митохондрий-селективного красителя MitoTracker CMXRos Red. Желтой флуоресценции в объединенной изображение демонстрирует совместное локализации логометрических-pericam-т и MitoTracker флуоресценции. (B) серии псевдо-отношение (495:380 нм) изображения 4 клеток HeLa выражения MT-логометрических pericam обрабатывают 10 мМ АТР . (С) Количественная оценка изменений в митохондриальной уровня кальция в области интереса (ROI), указанных в (б) обрабатывают 10 мМ АТФ. (D) серии псевдо-отношение (495:380 нм) изображения ячейки HeLa выражения тонн -логометрических pericam получавших 0,5 мкМ стауроспорин. Неоднородность в ответ кальция в отдельных митохондрий очевидна, а также значительная фрагментация митохондрий на 60 минут. Некоторые митохондрии имеют колебательный увеличение кальция (белая голова стрелка), тогда как другие не показывают значительных изменений в уровень кальция (желтая голова стрелка). (Е) Количественный рост глобальной митохондриальные уровни кальция в одной клетки HeLa после индукции апоптоза с 0,5 мкМ стауроспорин.

Discussion

Здесь мы представляем очень простой метод измерения митохондриального кальция использованием митохондриальной ориентированных логометрических pericam. Как показано на рисунке 1а, используя стандартные широкопольных оптики, без деконволюции можно легко просматривать отдельные митохондрии в клетках HeLa с приемлемой сигнал-шум. Это потому, что клетки HeLa, как и большинство клеток в культуре, значительно выравниваются, когда приверженец что исключает необходимость в конфокальной микроскопии или другой специализированной техники. Мы нашли аналогичные результаты в клетках Jurkat придерживался поли-лизин покрытием покровные ^8. В отличие от методологии использования красителей, это также возможно для неинвазивного мониторинга митохондриальной уровня кальция в течение нескольких часов с использованием генетически закодированы кальция такие показатели, как логометрических pericam (рис. 1E). Это особенно важно при анализе митохондриальной кальция во время гибели клеток. Кроме того, это также возможно для визуализации деления / фрагментация митохондрий в процессе апоптоза. Как показано на рисунках 1D и Е, стауроспорин лечение вызывает медленное увеличение кальция в отдельных субпопуляций митохондрии которых пики на 20 минут. Кальций уровней спуститься снова одновременно с митохондриальной фрагментации, прежде чем снова через 2 часа после лечения. Это согласуется с медленных волн в цитозольного кальция индуцированных стауроспорин лечения измерялась с помощью Фура-2 ^9. Таким образом, важной кинетической информацию можно получить, что невозможно с методами использования статических измерений. Хотя мы представили отношения, а не кальция концентрации на рисунке 1, можно откалибровать датчик на месте рассчитать абсолютные уровни кальция, ^{4, 10.} Одним из важных предостережение, чтобы рассмотреть, что логометрических pericam чувствителен к рН ^{4, 10.} Так как оба цитозольного и митохондриальной уровнях рН может резко измениться во время апоптоза ^11, это является важным фактором. Титрование рН в изолированных митохондриях выражения pericam демонстрируют, что увеличение [H ^+] увеличивает выброс pericam при возбуждении на 495 нм, при недостаточном эффекте от излучения стимулируется возбуждение при 410 нм, собственность, которая была использована для одновременного измерения как митохондриальной кальций и рН ^12. Таким образом, выборочный контроль выбросов с 410 нм возбуждения предоставляет средства для не-ratiometrically монитор митохондриального кальция со снижением забота о рН. Наконец, протокол, представленные здесь требуется только доступ к стандартным epifluorescent микроскоп с широко доступны фильтры, что делает эту технику доступной для большинства лабораторий.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Инвертированный широкопольный флуоресцентный кальциевый микроскоп для визуализации	Nikon Instruments	MEA53310	Любой широкопольный инвертированный микроскоп, оснащенный фильтрами возбуждения 380 нм/495 нм и соответствующими фильтрами длинных частот и излучения, может быть легко адаптирован для использования этого протокола.
Программное обеспечение для визуализации	Молекулярные устройства	Metafluor
Attofluor клеточная камера	Invitrogen	A-7816	Достаточно любой камеры для визуализации инвертированного микроскопа, которая обеспечивает перфузию.
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Большинство реагентов/протоколов для трансфекции будут подходящими для этих исследований
MitoTracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512