Этот протокол описывает метод в режиме реального времени измерения потоков митохондриального кальция флуоресцентные изображения. Метод использует циркулярно permutated YFP основе двойного возбуждения логометрических кальция датчика (логометрических pericam-м) выборочно выражается в митохондриях.
Методическая статья
Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Динамические изменения внутриклеточной концентрации кальция в ответ на различные стимулы регулируют многие клеточные процессы, такие как пролиферация, дифференцировка и апоптоз1. При апоптозе накопление кальция в митохондриях способствует высвобождению проапоптотических факторов из митохондрий в цитозоль2. В связи с этим представляет интерес прямое измерение митохондриального кальция в живых клетках in situ во время апоптоза. Флуоресцентная визуализация клеток с высоким разрешением, нагруженных двойным возбуждением ратиометрических и нератиометрических синтетических индикаторных красителей кальция, зарекомендовала себя как надежный и универсальный инструмент для изучения различных аспектов внутриклеточной кальциевой сигнализации. Измерение потоков цитозольного кальция с помощью этих методов относительно просто. Однако измерение уровней внутримитохондриального кальция в интактных клетках с использованием синтетических индикаторов кальция, таких как rhod-2 и rhod-FF, представляет собой более сложную задачу. Синтетические индикаторы, нацеленные на митохондрии, демонстрируют ослабленный ответ на повторяющиеся увеличения содержания митохондриального кальция и нарушают морфологию митохондрий3. Кроме того, синтетические индикаторы имеют тенденцию вымываться из митохондрий в течение нескольких часов, что делает их непригодными для длительных экспериментов. Таким образом, генетически кодируемые индикаторы кальция на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP)4 или экворина5, нацеленные на митохондрии, значительно облегчили измерение динамики митохондриального кальция. Здесь мы описываем простой метод измерения потоков митохондриального кальция в режиме реального времени в ответ на различные стимулы. Метод основан на флуоресцентной микроскопии «ратиометрического перикама» (ratiometric-pericam), который селективно нацелен на митохондрии. Ратиометрический перикам — это индикатор кальция, основанный на слиянии циклически переставленного желтого флуоресцентного белка и кальмодулина4. Связывание кальция с ратиометрическим перикамом вызывает смещение пика его возбуждения с 415 nm до 494 nm, в то время как спектр эмиссии с пиком около 515 nm остается неизменным. Ратиометрический перикам связывает один ион кальция с константой диссоциации in vitro около 1.7 μM4. Эти свойства ратиометрического перикама позволяют количественно оценивать быстрые и долгосрочные изменения концентрации митохондриального кальция. Кроме того, мы описываем адаптацию этой методологии к стандартному широкопольному микроскопу для кальциевого имиджинга с общедоступными наборами фильтров. Используя два различных агониста — пуринергический агонист ATP и индуцирующий апоптоз препарат стауроспорин, мы демонстрируем, что данный метод подходит для мониторинга изменений концентрации митохондриального кальция с временным разрешением от секунд до часов. Более того, мы также показываем, что ратиометрический перикам полезен для измерения деления/фрагментации митохондрий при апоптозе. Таким образом, ратиометрический перикам особенно хорошо подходит для непрерывного долгосрочного измерения динамики митохондриального кальция в процессе апоптоза.
Протокол
1. Pericam-т Трансфекция и клеточной подготовка.
- Пластина HeLa клетки ночь перед трансфекции на стерильные покровные стекла, помещаемых в стандартной 6-и культуру пластину.
- Подготовка ДНК / Lipofectamine 2000 комплексов в соответствии с предложением производителя (Invitrogen). Мы используем 4 мкг логометрических-pericam-т вектор экспрессии и 10 мкл Lipofectamine 2000 разводят в 0,5 мл Opti-MEM для каждой скважины. Камеры должны быть ~ 70% сливной до трансфекции.
- Замените HeLa питательных сред (Дульбеко изменение орлы среды, 10% FBS, пенициллин / стрептомицин) в каждую лунку с 1,5 мл того же средства массовой информации без антибиотиков.
- Добавить ДНК / Lipofectamine комплексов в каждую лунку для трансфекции. Осторожно перемешать с качалки и инкубировать в течение 4 часов в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО 2.
- Замените антибиотикам свободных средств массовой информации с питательной среды с помощью антибиотиков. Разрешить клетки, чтобы выразить логометрических pericam за 1-2 дня до съемки.
2. Установка микроскопа и Image Acquisition
- Место покровное с клетками HeLa в соответствующие камеры изображения с решением изображений: 107 мм NaCl, 7,2 KCl, 1,2 мм MgCl 2, 1 мМ CaCl 2, 11,5 мм глюкозы, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 20 мМ HEPES 7.2. Наша лаборатория использует камеру Attofluor клетку от Invitrogen. Горы изображения камеры в перевернутый столик микроскопа.
- Найти область интересов, содержащие один или несколько клеток, экспрессирующих логометрических pericam использовании 40x (или выше) нефти погружения цели. Мы обнаружили, что логометрических pericam менее устойчив к фотообесцвечивания при 380 нм, и, таким образом мы используем эту длину волны для определения подходящих клеток. Для изображений, полученных на рисунке 1, Nikon Superfluor 40X объектива с числовой апертурой 1,3 был использован. Высшие цели увеличения бы также целесообразным (60-100x). Возбуждение фильтры были использованы технологии Chroma фильтры D380/30x (380 + / - 30 нм) и D495/10 (495 + / - 5 нм), светоделитель был 505DCXR (505nm longpass), а также выбросов фильтр HQ535/50m (535 + / - 25nm).
Наш микроскоп используется для получения изображения на рисунке 1, состоит из Nikon TE2000 инвертированный микроскоп оснащен Ропер Научная Coolsnap HQ охлаждением ПЗС-камера, Ludl MAC6000 быстрого фильтра колесо и чейнджер, и приобретение MetaFluor данных и анализа программного обеспечения. Этот протокол может быть адаптирована к любым стандартным широким полем микроскоп с соответствующими фильтрами и программного обеспечения, способного захвата и обработки логометрических изображений. - Настройка программного обеспечения для использования двойного возбуждения 495 и 380 нм фильтра. Кальций привязки к логометрических pericam увеличивает абсорбцию при 495 нм, что коэффициент должен быть создан к 495 nm/380 нм.
Логометрический pericam имеет бескальциевой пика возбуждения при 415 нм 4. В этом протоколе мы предлагаем использовать 380 нм фильтра только потому, что повсеместно в большинстве лабораторий кальция изображений. Если 410 нм фильтра доступна, то предпочтительнее фильтр 380 нм. - Получение изображений последовательно альтернативно захватывающей на 495 и 380 нм. Получение изображений из базовых уровней кальция, по крайней мере 30 секунд до применения агонистов через перфузии аппарата. Марк того времени для каждого агониста. Выдержки раз и приобретение интервалы должны быть оптимизированы, чтобы предотвратить фотообесцвечивания в то же время обеспечивают достаточное временное например resolution.For, для полу-быстрому кальция динамики мониторинг в ответ на стимуляцию агонистами, изображения были приобретены через каждые две секунды на рисунках 1В и С. Гораздо быстрее ставки приобретения Возможны также 6. Долгосрочные изображений после стауроспорин администрации был приобретен с более длительным интервалом (30) между приобретений (рис. 1 D и Е).
3. Обработки и анализа изображений
- Как только эксперимент завершен, полученные изображения можно анализировать в автономном режиме. Определить регионы интереса (ROI), в которой вы хотите отслеживать изменения в уровни кальция. Используйте ROI выбран в пустую область поля вычесть фон, если это необходимо. Следует отметить, что митохондрии являются весьма подвижны и динамичны, и экстраполировать события в одной митохондрии в течение длительного периода не всегда возможно. Таким образом, учитывая высокую подвижность этой органеллы в некоторых типах клеток, выбор ROI должны быть тщательно проверены. Кроме того, о чем свидетельствует на рисунке 1, митохондрии ответ гетерогенно на различные раздражители. Поэтому очень важно для анализа данных в автономном режиме и контролировать RO1 размещения на кадр за кадром. Подробное описание измерения митохондриального кальция в сильно подвижных митохондрии была описана в другом месте 7.
- Полученный коэффициент измерений ROI могут быть импортированы в Excel или аналогичные graphingsoftware. Данные могут быть представлены в виде следов представляющего изменений в митохондриальной уровня кальция в одной ячейке или отдельные митохондрии, или усредненные этuorescence сигналы от нескольких ROI. Мы также использовали эту технику для измерения средней митохондриальные уровни кальция в популяции лимфоцитов проходит апоптоз, вызванный Fas лиганд 8.
4. Представитель Результаты:
Рисунок 1. (А) субклеточных локализации логометрических-pericam-т. Это первое изображение показывает живой клетки HeLa выражения логометрических-pericam-т. Второе изображение показывает флуоресцентного окрашивания митохондрий-селективного красителя MitoTracker CMXRos Red. Желтой флуоресценции в объединенной изображение демонстрирует совместное локализации логометрических-pericam-т и MitoTracker флуоресценции. (B) серии псевдо-отношение (495:380 нм) изображения 4 клеток HeLa выражения MT-логометрических pericam обрабатывают 10 мМ АТР . (С) Количественная оценка изменений в митохондриальной уровня кальция в области интереса (ROI), указанных в (б) обрабатывают 10 мМ АТФ. (D) серии псевдо-отношение (495:380 нм) изображения ячейки HeLa выражения тонн -логометрических pericam получавших 0,5 мкМ стауроспорин. Неоднородность в ответ кальция в отдельных митохондрий очевидна, а также значительная фрагментация митохондрий на 60 минут. Некоторые митохондрии имеют колебательный увеличение кальция (белая голова стрелка), тогда как другие не показывают значительных изменений в уровень кальция (желтая голова стрелка). (Е) Количественный рост глобальной митохондриальные уровни кальция в одной клетки HeLa после индукции апоптоза с 0,5 мкМ стауроспорин.
Обсуждение
Здесь мы представляем очень простой метод измерения митохондриального кальция использованием митохондриальной ориентированных логометрических pericam. Как показано на рисунке 1а, используя стандартные широкопольных оптики, без деконволюции можно легко просматривать отдельные митохондрии в клетках HeLa с приемлемой сигнал-шум. Это потому, что клетки HeLa, как и большинство клеток в культуре, значительно выравниваются, когда приверженец что исключает необходимость в конфокальной микроскопии или другой специализированной техники. Мы нашли аналогичные результаты в клетках Jurkat придерживался поли-лизин покрытием покровные 8. В отличие от методологии использования красителей, это также возможно для неинвазивного мониторинга митохондриальной уровня кальция в течение нескольких часов с использованием генетически закодированы кальция такие показатели, как логометрических pericam (рис. 1E). Это особенно важно при анализе митохондриальной кальция во время гибели клеток. Кроме того, это также возможно для визуализации деления / фрагментация митохондрий в процессе апоптоза. Как показано на рисунках 1D и Е, стауроспорин лечение вызывает медленное увеличение кальция в отдельных субпопуляций митохондрии которых пики на 20 минут. Кальций уровней спуститься снова одновременно с митохондриальной фрагментации, прежде чем снова через 2 часа после лечения. Это согласуется с медленных волн в цитозольного кальция индуцированных стауроспорин лечения измерялась с помощью Фура-2 9. Таким образом, важной кинетической информацию можно получить, что невозможно с методами использования статических измерений. Хотя мы представили отношения, а не кальция концентрации на рисунке 1, можно откалибровать датчик на месте рассчитать абсолютные уровни кальция, 4, 10. Одним из важных предостережение, чтобы рассмотреть, что логометрических pericam чувствителен к рН 4, 10. Так как оба цитозольного и митохондриальной уровнях рН может резко измениться во время апоптоза 11, это является важным фактором. Титрование рН в изолированных митохондриях выражения pericam демонстрируют, что увеличение [H +] увеличивает выброс pericam при возбуждении на 495 нм, при недостаточном эффекте от излучения стимулируется возбуждение при 410 нм, собственность, которая была использована для одновременного измерения как митохондриальной кальций и рН 12. Таким образом, выборочный контроль выбросов с 410 нм возбуждения предоставляет средства для не-ratiometrically монитор митохондриального кальция со снижением забота о рН. Наконец, протокол, представленные здесь требуется только доступ к стандартным epifluorescent микроскоп с широко доступны фильтры, что делает эту технику доступной для большинства лабораторий.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Atsushi Miyawaki за предоставление нам логометрических-pericam-т выражение построить. Эта работа была поддержана грантом GM081685 из Национального института здоровья (БД).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Инвертированный широкопольный флуоресцентный микроскоп для кальциевого имиджинга | Nikon Instruments | MEA53310 | Для использования данного протокола может быть легко адаптирован любой инвертированный широкопольный микроскоп, оснащенный возбуждающими фильтрами 380 нм/495 нм, а также соответствующими длинноволновыми и эмиссионными фильтрами. |
| Программное обеспечение для имиджинга | Molecular Devices | Metafluor | |
| Клеточная камера Attofluor | Invitrogen | A-7816 | Подойдет любая камера для имиджинга на инвертированном микроскопе, поддерживающая перфузию. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Для данных исследований будут подходящими большинство реагентов и протоколов трансфекции. |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
Ссылки
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
Перепечатки и разрешения
Теги
