Изображений С. Элеганс Эмбрионы использованием Epifluorescent Микроскоп и открытое программное обеспечение

Summary

С. Элеганс Эмбрион представляет собой мощную систему для изучения клеточной биологии и развития. Мы представляем протокол для живых изображений С. Элеганс Эмбрионов использования DIC оптике или флуоресценции с помощью доступной epifluorescent микроскопы и с открытым исходным кодом.

Abstract

Клеточных процессов, таких, как хромосомы сборки, сегрегации и цитокинеза, по своей природе динамичны. Покадровый изображений живых клеток, с помощью флуоресцентного меченых белков репортер или дифференциального интерференционного контраста (DIC) микроскопии, позволяет рассмотрение временной прогрессии этих динамических событий, которые в противном случае вывести из анализа основных ^1,2 образцов. Более того, изучение правил развития клеточных процессов требует проведения покадровой эксперименты на здоровом организме в процессе разработки. Эмбриона Caenorhabiditis Элеганс светло-прозрачных и быстрых, инвариантной развития программы с известными клеточной линии ^3, что обеспечивает идеальную модель эксперимента по изучению вопросов в области клеточной биологии и развитие ^{4,5 6-9.} С. Элеганс является исправимый к генетическим манипуляции вперед генетики (на основе случайного мутагенеза ^10,11) и обратной генетики для решения конкретных генов (на основе РНК-интерференции-опосредованного вмешательства и направленного мутагенеза ^12-15). Кроме того, трансгенные животные легко могут быть созданы для выражения флуоресцентно меткой белки или ^16,17 журналистам. Эти черты объединяются, чтобы сделать его легко идентифицировать генетические пути регулирующих основных клеточных и процессов развития в естественных условиях ^18-21. В этом протоколе мы представляем методы для живого изображения С. Элеганс эмбрионов использованием DIC оптике или GFP флуоресценции от соединения epifluorescent микроскопом. Мы демонстрируем легкость, с которой доступны микроскопы, как правило, используется для фиксированных изображений образца, могут также применяться для покадровой анализ с использованием открытого программного обеспечения для автоматизации процесса визуализации.

Protocol

Подготовка Worm

1. Передача L4 личинок червей, чтобы соответствующие пластины 18-24 часов до ²² изображений. Это позволит вам иметь икряных взрослых достаточный запас ранних эмбрионов.
2. Подготовка труб вазелина и агарозы. Мы готовим несколько 15 мл пробирки сокола сплавлением вазелина в стакане, в микроволновой печи и отпуск на 4-5 аликвоту мл на трубе. Аналогично расплава 2-3% (м / о) агарозы в буфере (М9 или яйцо буфера) и аликвоту 4-5 мл в пробирки, сокол. Будьте осторожны, не кипятить, чтобы избыточные для того, чтобы свести к минимуму испарение. В день получения изображений, растопить 1 тюбик вазелина в 65-70 ° C тепла блока и растопить 1 тюбик агарозы в микроволновой печи, опять же будьте осторожны, чтобы минимизировать кипит. Магазин труб в тепло блок сохранить вазелин и агарозы в расплавленном состоянии.
3. Сделать агарозном площадку. Позиция нового слайда микроскопии между 2 горки руководства, которые слайды покрывается одним слоем общей ленте лаборатории придерживаться верхней и нижней части каждой направляющей слайда. Используйте пипетку Пастера с конца прерваны размещать 2-3 капли расплавленного агарозном на новый слайд. Крышка с ^2-й слайд перпендикулярно к исходному слайду, так что она покрывает и способствует распространению агарозы для создания тонкой квадратной площадке. ^2-й слайд должна лежать выше ленты на руководство слайдов. Концентрация агарозы может быть увеличена до 5% для более толстых прокладок.
4. Использование рассекает масштаб и платиновой проволоки "забрать", передача 2 червей взрослый 9-12μL каплю буфера M9 или яйцо на 18 мм х 18 мм покровным.
5. Вырезать червей открыть с помощью иглы (мы используем 27G1 / 2 иглы) или скальпелем, чтобы освободить эмбрионов. Попробуйте сократить в середине червя.
6. Нижняя агарозном площадку (с агар стороной вниз) на покровное 18х18 мм содержащих эмбрионы. Trim агар простирается от края покровным стеклом с лезвия бритвы.
7. Печать покровное с помощью кисти или тонкой деревянной палочкой применять расплавленного вазелина на все четыре края покровного стекла.

Альтернатива агар монтирует висят капли ^23, если эмбрионы восприимчивы к давлению (то есть, если яичной скорлупы не образует должным образом). Изображений может быть выполнено внутриутробно следовать оплодотворения или в начале событий, таких как мейоз. Черви должны быть под наркозом с Левамизол ^24. В целях увеличения количества эмбрионов из конкретной стадии развития, некоторые черви могут быть рассечен в одно время и эмбрионов позиционируется вместе мягко использовании тонкой кончика пипетки или ресницы кистью или через рот пипеткой.

4D Номарского DIC (Контрастность дифференциальных помех) Фильмы

8. Включите микроскопа Olympus BX61. Так как камера чувствительна к ЭМ волн, испускаемых другими устройствами он включен последний, лампы ртуть (если это необходимо для GFP или флуоресценции) в первую очередь. Начало Micro-менеджер, как только все включено. Выберите соответствующий файл конфигурации для ДВС или флуоресцентные изображения. Основное различие заключается в том, что DIC файл не содержит контроль флуоресцентных затвора. Каждый файл также выбирает соответствующий фильтр куба и настройки камеры выгоды.
9. Найти эмбрионов на микроскопе использовании 10x цели. Посмотрите рядом червь органов для группы молодых эмбрионов для того, чтобы получить несколько эмбрионов в течение визуализации поля. Избегайте эмбрионами внутри червя для наилучшего качества изображения.
10. Использование программного обеспечения перейти на большем увеличении (40х до 100х) и резолюции (NA 0,9 до 1,4) цель для работы с изображениями.
11. Отрегулируйте Номарского DIC оптики (следующие веб-сайты содержат полезные объяснения DIC оптики и терминологии; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
    http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)
    1. На нашем Olympus BX61 важными компонентами являются:
       1. Поляризатор - ползунок внизу конденсатора
       2. Конденсатор Волластон Prism - башенка на конденсаторе, чуть ниже сцены.
       3. Цель Волластон Prism - ползунок внизу светофильтров
       4. ^2-го поляризатора (анализатора) - фильтр куб в DIC позиции
    2. Переключатель фильтра Куб DIC позиционировать Analyzer ^(2-й поляризатор), в свете пути (программное обеспечение должно сделать это при запуске).
    3. Убедитесь, что два поляризатора были должным образом увязаны (зачеркнуто). Когда оба Волластон призмы из светового луча в поле зрения должно быть темным. При необходимости повернуть поляризатор ниже конденсатора, пока это правильно.
    4. Вставьте цель (верхний) Призма Волластона в пучке света.
    5. Поворот башни на конденсаторе, чтобы выбрать призму Волластона, который соответствует цели вы используете.
    6. Отрегулируйте ползунок внизу этой башни, чтобы соответствовать НС линзы.
    7. Фокус конденсатора для оптимального освещения Келер.
    8. Отрегулируйте верхний Волластон Priсм, чтобы получить оптимальную контрастность поворотом ручки на слайдер.
    9. Другие параметры контролируются запуска программного обеспечения включают усиление камеры (значение 0) и перейти на сохранение файлов как 8-битные не 16-разрядные файлы TIFF.
12. Отрегулируйте уровень освещенности, чтобы дать хорошее изображение. (Обычно используют 4,7 Вольт) (управляется с помощью программного обеспечения). Мы предпочитаем, чтобы осветить образец так, чтобы яркие пиксели чуть ниже уровня насыщения.
    Хорошие результаты DIC оптики в изображение с 3-мерной посмотреть, где желточных гранул в эмбрион четко выделяться. Кроме этого может быть описана как если бы свет, освещающий образец появляется до блеска под углом так, чтобы одна сторона образца (или функции в образце) горит ярко и противоположная сторона находится в тени и выглядит темнее.
13. Выбор региона интереса (ROI) для включения эмбрионов вы хотите, чтобы изображение, нажмите кнопку набора ROI уменьшить окно.
14. Открытое многомерных приобретение окна. Выберите Z-стеки (кусочки) и временных точках.
15. Используйте ручку микроскопа фокус, чтобы найти в нижней части эмбриона (пред. фокальной плоскости с некоторыми желточных гранул в фокусе). Нажмите на Выбрать дно. Повторите, чтобы определить и верхней части эмбриона. Мы обычно используем 1 мкм размер шага и в конечном итоге с ~ 20 фокальных плоскостях. Как правило, мы собираем несколько фокальных плоскостей в каждый момент времени, так как эмбрионы и клетки относительно толстые. Кроме того особенно, когда клетки начинают делиться в разных направлениях они могут замещать другие клетки вокруг в эмбрионе их перемещения в или из оригинального фокальной плоскости. Если ваш микроскоп не имеет моторизированный фокус можно вручную настроить фокус следовать ячейки или процесса вы заинтересованы.
16. Входное число временных точек и интервал времени необходимо. Мы обычно используем 15 секунд интервала и установить максимум 500 баллов времени. Начнем с более точек времени, чем нам нужно остановиться и приобретения, когда это необходимо. Если вы визуализации нескольких фокальных плоскостей, убедитесь, что было достаточно времени, чтобы приобрести все фокальной плоскости в интервале между моментами времени.
17. Выберите или создайте папку для сохранения данных. Убедитесь, что программное обеспечение установлено на табло остается последнее изображение только. Дайте файлу имя и нажмите кнопку Acquire. Монитор автоматизированного захвата изображений в течение первых нескольких моментов времени, чтобы убедиться, что он работает нормально.
18. Нажмите остановиться, когда вы хотите, чтобы остановить приобретение, переключиться на 10x объективных и подготовить следующий слайд.
19. После завершения визуализации удалить DIC компонентов из светового луча. Чистое масло от цели, если это необходимо. Включите все прочь, начиная с камерой.

GFP фильмы

20. Начало микроскопа и найти эмбрионов, что и выше. Используйте файл конфигурации, который включает в себя программное обеспечение для управления флуоресцентных затвора.
21. Убедитесь, что верхняя DIC призмы (слайдер) не находится в пучке света.
22. Переключатель фильтра Куб FITC / GFP (автоматически устанавливается при запуске)
23. Изменение усиление камеры до 255, а файл изображения для 16-битных TIFF (автоматически устанавливается при запуске с этой конфигурацией файла).
24. Выключите белый свет.
25. Нажмите Живая изображений для предварительного просмотра изображений. Работают быстро, чтобы минимизировать воздействие света. Также можно использовать оснастку изображения собрать единое изображение.
26. Отрегулируйте Меркурий лампочка / нейтральные фильтры, экспозиция длины, чтобы получить хорошее изображение. В общем, вы должны использовать минимум света, достигающего образец приобретать данные, которые вы хотите уменьшить фотоповреждения к клетке и фотообесцвечивания сигналов флуоресценции.
27. Настройка временной интервал, количество временных точек и число фокальных плоскостях. Мы часто используем секундным интервалом 5-10 и 1-3 фокальной плоскости.
28. Выберите рентабельности инвестиций и задать параметры для получения изображений, как описано ранее в шагах 13-19.

Анализ фильмы

29. Данные будут сохранены в папке с введенное вами имя и содержат ряд файлов TIFF для каждого изображения из стека 4D, текстовый файл и файл XML, содержащий метаданные, такие как уровни воздействия и временных интервалов.
30. TIFF изображения может быть открыт ImageJ с помощью двух методов. Первая (метод) является самым простым, а также будет читать метаданных каждого файла. Второй (метод б) имеет возможность использовать виртуальную память для открытых файлов, размер которых превышает объем памяти, выделенный для ImageJ, но оно не включает в себя метаданные.
    1. Использование микро-менеджер плагинов
       1. Micro-Manager построен на и использует ImageJ (он устанавливает новую версию ImageJ которая будет отличаться от любой другой версии, которая у Вас может быть установлен ранее) и включает в себя плагин для открытия данных. Или же вы можете скопировать содержимое папки Micro-Manager-1.3/plugins в папку плагинов для другой версии ImageJ.
       2. Зайдите в меню Плагины, выберите Micro-Manager, а затем Открыть Micro-File Manager.
       3. Выберите папку, содержащую данные, которые вы хотите просмотреть, и нажмите кнопку ОК.
       4. Игра через Z и T размеров.
    2. Использование ЛОКУСОВ plugiN, чтобы открыть фильмы с Импортер BioFormats.
       1. Передача XML и текстовые файлы из папки, содержащей файлы TIFF, а также переименовать два файла совпадает с именем набора данных.
       2. В ImageJ, перейдите на плагины выпадающее меню, выберите ЛОКУСОВ, а затем либо данных браузера или био-форматы Importer.
       3. Найдите папку с вашим стеки TIFF. Нажмите на первый файл TIFF, а затем открыть.
       4. Просмотр стека с HyperStack. Под набором данных организации: Выбор группы файлов с размерами похожие имена, Swap и открыть все серии. Под Управление памятью: Выберите: Используйте виртуальный стек (особенно для больших наборов данных). Нажмите ОК
       5. Плагин будет определять размеры набор данных (кол-во временных точках и координационные плоскости) и отображения в диапазоне от набора <> скобках. Нажмите кнопку ОК или изменить количество временных точек и / или фокальных плоскостях, чтобы открыть.
       6. Подтвердите которых величина соответствует каждой серии.
       7. Игра через Z и T размеров.

Представитель Результаты

Рисунок 1. Кадры из фильма Номарского DIC иллюстрирующие нормальных клеточных событий в начале C. Элеганс развития эмбриона: пронуклеусов миграции (0-5:45), асимметричный первом дивизионе (6:45-14:45) и асинхронных второго дивизиона (14:45-27:00). Данные были собраны с 60x объектив 1,35 NA. 20 фокальных плоскостях с интервалом в 1 микрон собирались каждые 15 секунд с 40 воздействия мкс. Изображения были повернуты так, что задняя находится справа и брюшной не работает. Шкала Бар составляют 10 микрон.

Рисунок 2. Кадры из фильма флуоресцентные иллюстрирующих динамическое движение GFP-меченых субъединицы пассажирского комплекса хромосомы (AIR-2) присутствовать на хромосомы от метафазы к ранней анафазе (С) перед тем как появиться на шпинделе midzone в анафазе до цитокинеза завершает (от С до F). Данные были собраны с 60x объектив 1,35 NA. Одной фокальной плоскости была собрана через каждые 10 секунд с 50 мкс экспозиции. Изображения были повернуты так, что задняя находится справа. Шкала Бар составляют 10 микрон.

Фильм 1 Номарского фильм дикого типа эмбрионов.
Фильм, соответствующий рисунку 1. Задняя является правом нижнем углу и брюшной является нижнем левом углу. Показывает одну фокальной плоскости оригинального набора данных. Изображение было собрано каждые 15 секунд и воспроизводить установлена ​​на уровне 14 кадров в секунду. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео

Фильм 2 Флуоресцентный фильм дикого типа эмбрион выражения GFP:: AIR-2.
Фильм, соответствующий рисунку 2. Задняя является правом верхнем углу. Фильм был собран как единый фокальной плоскости. Изображение было собрано каждые 10 секунд и воспроизводить установлена ​​на уровне 14 кадров в секунду. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео

Discussion

Основным критерием для живых покадровой визуализации является сохранение целостности и жизнеспособности клеток и организма. DIC микроскопии обеспечивает преимущество, что образец не подвергался воздействию ультрафиолетового света и чрезмерного нагрева от источника света. DIC микроскопии хорошо подходит для обнаружения миграции клеток и изменения формы, такие как цитокинеза и определить некоторые субклеточные структуры, такие как шпиндель митотической и ядерные мембраны. Флуоресценции репортера белков дополняет DIC микроскопии путем выявления дополнительных отсеков и субклеточных позволяет визуализации специфических белков. Для снижения опасности фототоксичности и повреждения эмбриона во флуоресценции, мы обычно увеличения цифровых усиления камеры, чтобы компенсировать снижение интенсивности ультрафиолетового света и продолжительность освещения. Для слабых флуоресцентных трансгенных репортеров, алгоритмы деконволюции переназначить вне фокусировки света или устранения размытости алгоритмы для снижения фона может улучшить качество снимков. Хотя передовые микроскопы, таких как конфокальной или многофотонной системы иногда необходимо, мы обнаружили, что многие флуоресцентные журналисты могут быть отображены с помощью этой установки epifluorescent микроскоп, что дает высокое качество изображения.

Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), в дополнение к тому, бесплатно, сохраняет файлы непосредственно в формат TIFF, а не собственные форматы файлов многих коммерческих программных пакетов. Это значительно упрощает анализ наших данных, устраняя шаг преобразования файлов необходимая для чтения файлов изображений в ImageJ, Photoshop и других программ для редактирования изображений.

Materials