Пассирования правам нервные стволовые клетки

Summary

Способность манипулировать человеческой нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) в пробирке позволяет исследовать их полезность в качестве клеточных трансплантатов для использования в терапевтических целях, а также изучить человеческие развития нервной системы. Этот протокол представляет метод культивирования и пассажи hNSPCs в надежде на повышение воспроизводимости человеческого исследования стволовых клеток.

Abstract

Способность манипулировать человеческой нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) в пробирке предоставляет средства для изучения их полезность как клеточных трансплантатов для использования в терапевтических целях, а также для изучения многих фундаментальных процессов человеческого развития нервной системы и патологии. Этот протокол представляет собой простой метод культивирования и пассажи hNSPCs в надежде на стандартизацию этой техники и повышения воспроизводимости человеческого исследования стволовых клеток. HNSPCs мы используем были изолированы от трупного послеродовой коры мозга, о человеческом нейронных стволовых клеток ресурсов и выросли как приверженец культур на колбы покрыты фибронектина (Palmer и др., 2001;.. Шварц и др., 2003). Мы культуре нашей hNSPCs в DMEM: F12, свободной от сыворотки среде с EGF, FGF и PDGF и прохождение их 1:02 примерно раз в семь дней. Используя эти условия, большинство клеток в культуре поддерживать морфологии биполярных и выражать маркеры недифференцированных нервные стволовые клетки (например, нестин и Sox2).

Protocol

Примечание: Для рутинной культивирования наших hNSPCs, мы меняем 50-100% от средств массовой информации каждый день, и обычно их прохождения 1:02 раз в неделю. Медиакультуры содержит 20% BIT-9500, 1X антибиотик / противогрибковым, и факторы роста (EGF, FGF и PDGF каждый на 40 нг / мл) в DMEM: F12 СМИ базу.

Подготовка покрытием колбы и окончательно оторвать Клетки

1. Для подготовки новых контейнеров для пассировать клетки, пальто T25 колбы с 10 мкг / мл человеческого фибронектина в EMEM течение 4 часов, или на ночь, на 37 ° C культуре ткани инкубатора. Прямо перед пассирования клеток, фибронектина удалить раствором и промыт....

Discussion

Мы обнаружили, что этот протокол обеспечивает надежную культур hNSPCs. Одним из важнейших факторов для наших клеток является то, что они должны быть как достаточно плотная культуры и не может быть пассировать до того, что клетки являются редкими. В наших руках, редкие культуры растут очень медленно или полностью прекратить делиться. По этой причине мы, как правило расколоть нашу культуру 1:2 или 1:3, когда культура чрезвычайно плотной. Покрытие поверхности культуры блюдо с фибронектина очень важно, поскольку оно способствует правильное прик.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, инсулин, трансферрин)		Реагент Технологии стволовых клеток	09500
Антибиотик-антимикотический	реагент	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Реагент	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Реагент	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Распространяется компанией Fisher под указанным каталогом #
Фетальная бычья сыворотка		Реактив Invitrogen	10437-028
FGF, человеческий основной рекомбинантный	Реактив	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	Реактив	PeproTech Inc	100-00AB
EGF, человеческий рекомбинантный	Реактив	BD Biosciences	CB40052	Распространяется компанией Fisher под указанным каталогом #
Cell Culture Flask, 25 см2	Tool	Corning	10-126-28	Распространяется компанией Fisher под указанным каталогом #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Распространяется компанией Fisher под указанным каталогом #
Human Neural Stem/Precursor	Cells Cells	National Human Neural Stem Cell Resource
Буферный реагент для диссоциации клеток		Invitrogen	13150-016