$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Определение субклеточного распределения сигнальных комплексов является обязательным условием для понимания выхода этого комплекса. Традиционные методы, такие как иммунопреципитация, не дают информации о пространственной локализации комплексов. В отличие от этого, BiFC контролирует взаимодействие и субклеточную компартментализацию белковых комплексов. В этом методе флуоресцентный белок расщепляется на амино- и карбокси-концевые нефлуоресцентные фрагменты, которые затем сливаются с двумя белками, представляющими интерес. Взаимодействие белков приводит к восстановлению флуорофора (рис. 1)1,2. Ограничением BiFC является то, что после восстановления фрагментированного флуорофора комплекс становится необратимым3. Это ограничение полезно при обнаружении переходных или слабых взаимодействий, но исключает кинетический анализ сложной динамики. Дополнительное предостережение заключается в том, что восстановленному флуорофору требуется 30 минут для созревания и флуоресцирования, что опять же исключает наблюдение завзаимодействиями в реальном времени. BiFC является конкретным примером анализа комплементации белковых фрагментов (PCA), в котором используются репортерные белки, такие как зеленые флуоресцентные варианты белка (BiFC), дигидрофолатредуктаза, b-лактамазы и люцифераза для измерения взаимодействий белок:белок5,6. Альтернативные методы изучения взаимодействия белка с белком в клетках включают флуоресцентную колокализацию и резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET)7. Для колокализации два белка помечаются по отдельности либо непосредственно флуорофором, либо с помощью непрямой иммунофлюоресценции. Однако такой подход приводит к высокому фону невзаимодействующих белков, что затрудняет интерпретацию данных колокализации. Кроме того, из-за пределов разрешающей способности конфокальной микроскопии два белка могут казаться колокализованными, не обязательно взаимодействуя. При использовании BiFC флуоресценция наблюдается только при взаимодействии двух представляющих интерес белков. FRET — еще один отличный метод изучения взаимодействия белка и белка, но он может быть технически сложным. Эксперименты с FRET требуют, чтобы донор и акцептор имели одинаковую яркость и стехиометрию в клетке. Кроме того, необходимо учитывать проток донора в акцепторный канал и наоборот. В отличие от FRET, BiFC имеет слабую фоновую флуоресценцию, слабую постобработку данных изображения, не требует высокой сверхэкспрессии и может обнаруживать слабые или переходные взаимодействия. Биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) — это метод, аналогичный FRET, за исключением того, что донором является фермент (например, люцифераза), который катализирует субстрат для превращения в биолюминесцентный, тем самым возбуждая акцептор. BRET не обладает техническими проблемами, связанными с просвечиванием и высокой фоновой флуоресценцией, но не обладает способностью предоставлять пространственную информацию из-за отсутствия локализации субстрата в конкретных отсеках8. В целом, BiFC является отличным методом визуализации субклеточной локализации белковых комплексов, чтобы получить представление о компартментализации сигнализации.