Анализ функций малого ГТФаз по микроинъекции Плазмиды в поляризованных эпителиальных клеток

Краткое содержание

Эта статья подробно описывает процедуры, связанные с гиперэкспрессией и анализа малых ГТФаз в поляризованных эпителиальных клеток с помощью микроинъекции техники.

Аннотация

Эпителиальные клетки поляризуют свою плазматическую мембрану на биохимически и функционально различные апикальные и базолатеральные домены, где апикальный домен обращен к "свободным" поверхностям, а базолатеральная мембрана находится в контакте с субстратом и соседними клетками. Оба мембранных домена разделены плотными соединениями, которые образуют диффузионный барьер. Апикально-базолатеральная поляризация может быть успешно повторена в культуре, когда эпителиальные клетки, такие как клетки собачьей почки Мадина-Дарби (MDCK), высевают с высокой плотностью на поликарбонатных фильтрах и культивируют в течение нескольких дней ^{1 2}. Установление и поддержание полярности клеток регулируется массивом малых ГТФаз надсемейства Ras, таких как RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 и Rab13 ^{3 4 5 6 7}. Как и все ГТФазы, эти белки циклически переключаются между неактивным состоянием, связанным с GDP, и активным состоянием, связанным с GTP. Специфические мутации в областях связывания нуклеотидов препятствуют этому циклу ⁸. Например, Rab13T22N навсегда заблокирован в форме GDP и, таким образом, назван «доминирующим отрицательным», в то время как Rab13Q67L больше не может гидролизовать ГТФ и, таким образом, находится в «доминирующем ^{активном»} состоянии. Для анализа их функции в клетках как доминантные, отрицательные, так и доминантные активные аллели ГТФаз обычно экспрессируются на высоких уровнях, что препятствует функции эндогенных белков ⁹. Элегантным способом достижения высокого уровня гиперэкспрессии за короткий промежуток времени является введение плазмид, кодирующих соответствующие белки, непосредственно в ядра поляризованных клеток, выращенных на фильтрующих носителях, с помощью техники микроинъекций. Это часто сочетается с совместной инъекцией репортерных плазмид, которые кодируют рецепторы плазматической мембраны, специфически отсортированные к апикальному или базолатеральному домену. Грузом, часто используемым для анализа сортировки груза до базолатерального домена, является чувствительный к температуре аллель гликопротеина вируса везикулярного стоматита (VSVGts045) ¹⁰. Этот белок не может правильно сворачиваться при 39°C и, таким образом, будет сохраняться в эндоплазматическом ретикулуме (ER), в то время как представляющий интерес регуляторный белок собирается в цитозоле. Сдвиг до 31°C позволит VSVGts045 правильно сложиться, покинуть ER и переместиться к плазматической мембране ¹¹. Это преследование обычно выполняется в присутствии циклогексимида для предотвращения дальнейшего синтеза белка, что приводит к более чистым результатам. Здесь мы подробно опишем процедуру микроинъекции плазмид в поляризованные клетки и последующую инкубацию, включая температурные сдвиги, которые позволяют провести всесторонний анализ регуляторных белков, участвующих в базолатеральной сортировке.

Протокол

1. Выделение плазмидной ДНК

1. Используйте Sigma-Aldrich эндотоксина бесплатный комплект maxiprep подготовить эндотоксина свободной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Этот комплект работает на нас, потому что она надежно удаляет любые эндотоксинов из препаратов ДНК. Эндотоксины, которые вводили ДНК в ядрах клеток приводит к гибели клеток.
2. Добавить 100 мкл фенола / chlorofom / изоамилового спирта (25:24:1), чтобы выделенной ДНК, вихревые и спина в течение 1 мин при 13000 оборотов в минуту в микроцентрифужных Эппендорф. Передача верхней фазы воды в новую пробирку и добавить 100 мкл хлороформа / изоамилового спирта (24:1), вихревые и спин, что и выше. Передача верхней фазе воды, содержащие ДНК, чтобы новые трубы. Этот шаг необходим для удаления белка из ДНК, которая предотвращает засорение микроинъекции иглы.
3. Осадок ДНК, добавив Na ацетат (рН 6,0) до конечной концентрации 300 мМ и 2 х т. 100% этанола. Инкубировать при температуре -20 ° С в течение ночи. Спиновые ДНК в течение 20 мин при 13000 оборотов в минуту в микроцентрифужных Эппендорф, мыть один раз с 70% этанола, и ресуспендируют в 300 мкл эндотоксина без воды (Sigma-Aldrich).
4. Определение концентрации ДНК. Типичная концентрация ДНК составляет от 1 до 5 мкг / мкл.

2. Культура MDCK клетках

1. Сплит MDCK клеток. Граф клеток и семян 4 х 10 ⁵ клеток на ясно 12-мм фильтры Transwell (0,4 мкм, размер пор, Corning Costar, 3460). Для эксперимента содержащие макет инъекции управления и двух различных мутантных белков Раб нужно семян трех фильтров.
2. Культуры MDCK клеток в среде MEM с 2 мМ L-глутамина, 0,1 мг / мл пенициллина / стрептомицина и 7% (об / об) эмбриональной телячьей сыворотки (= СМИ MEM роста) при 37 ° С и 5% СО _2.
3. Изменение информации в базолатеральной камеру каждый день. Это способствует поляризации процесс, так как он имитирует ситуацию эпителиальных клеток у животных.
4. 2-х дней после посева проверки в микроскоп ли клетки растут в закрытой монослоя. Если вы не можете обнаружения возможных дыр в монослой, выполнить свой эксперимент на 3 день. Если Есть еще дыры, выполнить свой эксперимент на 4-й день.

3. Процедура Микроинъекция и после инъекции Инкубации

1. В день эксперимента подготовить 5 мл MEM питательной среды плюс 50 мМ HEPES в одном 60 х 15 мм пластины для каждого фильтра и поместить в 39 ° C инкубатора. Кроме того, создать одну лунку 12-луночного планшета с 1 мл MEM питательной среды плюс 50 мМ HEPES и 0,1 мг / мл циклогексимид в фильтр, и поместите в 31 ° C инкубатора.
2. Включите микроинъекции микроскопа и установить его нагревают этапе до 39 ° C. Мы используем инвертированного микроскопа (Axiovert 200, объективом Carl Zeiss MicroImaging, Inc) с подогревом этапе, 10X и 32X цели и Эппендорф Femtojet (Injectman Ni2). И наконец, открыть резервуар азота, которая поставляет воздух стол с азотом.
3. Развести ДНК с фильтрованной водой (используйте фильтр 0,2 мкм) до конечной концентрации 0,2 мг / мл в общем объеме 10 - 100 мкл. Впоследствии, спина ДНК в микроцентрифужных Эппендорф при 13000 оборотов в минуту в течение 30 мин. Снимите верхнюю часть и место в новой трубки. Этот шаг гарантирует, что при загрузке вашего разбавленный ДНК в микроинъекции иглы вы можете точно нагрузки "чистым" ДНК. Ваша ДНК готов к микроинъекции.
4. Подготовка клетки, взяв первый из фильтра его культуры блюдо. При хирургическом лезвия (перо Хирургическое Blade, нержавеющая сталь, № 11), вырезать фильтр из держателя фильтра и поместить в 5 мл, 39 ° С теплыми питательной среды MEM плюс 50 мМ HEPES (60 х 15 мм пластины). Взвесьте вниз фильтра в культуре пластину с лезвием хирургического вы использовали для резки его. Поставьте его на фильтр так, что отверстие хирургические лезвия окружает середине фильтра. Наведите культуры пластины на нагревательный столик микроскопа.
5. Нагрузка 2-3 мкл разбавленного вашей ДНК (в данном случае кодирования плазмид VSVGts045-GFP = макет контроль инъекций) в микроинъекции иглы (Femtotip II, Эппендорф, 930000043), твист защитную крышку иглы и дать ему упасть на пол . Теперь игла готова быть пьяным в держатель. Для этого нажмите клавишу меню вашего injectman и убедитесь, что клапан закрыт. Винт иглу в держатель, будьте осторожны, чтобы не винт в иглу слишком сильно, поскольку это может привести к поломке. Теперь, нажмите клавишу меню снова, применяемые Р _С предотвратит СМИ от того, всасывается в иглу во время процедуры microinjeciton. Наконец, нажмите джойстик, чтобы стереть хранится самонаведения.
6. Чтобы опустить иглу на клетки, используйте 10X цель и принести иглу в луч света над жидкостью. Теперь акцент на клетки, довести фокус снова, повернув колесо фокус 180 ° вверх, и найти иголку. Впоследствии, медленно перемещайте иглы в центр внимания, а затем привести в фокусе снова (рабочие по приведению клетки в центре внимания снова), сбить иглу длякли снова. Повторяйте, пока игла не коснется поверхности средствах массовой информации, и в этот момент все, что вы увидите, это гало. Когда вы дойдете до точки, в которой клетки находятся в центре внимания, но иглы все еще нечеткое (то есть из фокальной плоскости) изменение целей 32X и тонкой грубой настройки.
7. Установите Z-лимит, касаясь апикальной мембраны с кончиком иглы и вычитая около 10 мкм, как ядер закладываем около 10 мкм под апикальной мембраны.
8. После установки Z-предел, найти правильное давление впрыска. Начало в 95 PSI. Если давление слишком высокое, ваши клетки взорвется. Если давление слишком низкое, то вы увидите белую точку, которая остается, но ничего не происходит. При успешной инъекции, вы увидите изменения фазы без изменения размера ячейки. Для инъекций, принесите иглу пару микрон из фокальной плоскости как можно быстрее. Цель с иглой над ядром (т.е. середина отдельной клетки) и нажмите инъекции клавишу джойстика, но не удерживайте кнопку нажатой.
9. Inject 100-500 клеток в отверстие вашего хирургического лезвия, которая лежит на ваших клеток. Когда вы закончите, поместите клеток с блюдом культуры и хирургические лезвия в 39 ° C инкубатор, и инкубировать в течение 2 ч. За это время VSVGts045-GFP выражается и выделяются в ER. Тем не менее, на 39 ° C, VSVGts045-GFP не раз правильно и, следовательно, не могут оставлять ER. Между тем, небольшие ГТФ интерес будет накапливаться в цитозоле в сотрудничестве инъекции экспериментов.
10. Через 2 ч, разместить клеток в 1 мл MEM питательной среды плюс 50 мМ HEPES и 0,1 мг / мл циклогексимид в 12-луночного планшета и инкубировать в течение 2 ч при 31 ° C. За это время погони, VSVGts045-GFP сбросят правильно, оставьте ER и поставляется на поверхности клетки.
11. Повторите шаги с 3,1 - 3,10 для фильтров два (плазмиды вводить кодировку VSVGts045-GFP и, например, V5 с метками Rab13T22N) и три (вводят плазмиды кодирования VSVGts045-GFP и, например, V5 с метками Rab13Q67L). Каждая инъекция займет около 20 - 60 мин. Тем не менее, она имеет решающее значение для лечения каждого фильтра так же всей температурный сдвиг инкубации и поверхностные окрашивания до устранения клеток. После фиксации, вы можете выполнять всю оставшуюся окрашивание протокола для всех фильтров в то же время.

4. Поверхностное окрашивание для иммунофлуоресценции анализа

Обратите внимание, во избежание отбеливания GFP сигнал VSVGts045-GFP, защищают образцы от света, покрывая с алюминиевой фольгой в течение всех последующих процедур.

1. Если вы хотите выполнить окрашивание поверхности, поместите клеток в культуре блюдо на металлическую пластину на льду и мыть клетки 1X с ледяным PBS ^{2 +} (PBS [0,2 г / л KCl, 0,2 г / л KH ₂ PO _4, 8 г / л NaCl и 2,17 г / л Na ₂ HPO ₄ х 7 H ₂ O] плюс 0,1 г / л CaCl ₂ и 0,1 г / л MgCl ₂ х 6 H ₂ O). Впоследствии, место 30 мкл антител, которая признает эктодомена вашего белка, в данном случае мышиных моноклональных антител TK1 (IgG _1, полученные с конца Томас Kreis), на чистую парафильмом размещены на металлическую пластину на льду. Место фильтр с вашим клеткам с ног на голову на капли и добавить несколько капель антител на обратной стороне фильтра. Инкубируйте в течение 1 часа на льду.
2. Место клеток в 12-луночного планшета, мыть 3X с ледяным PBS ^{2 +} (или RT теплой PBS ^{2 +} без предварительного окрашивания поверхности), и исправить с 3% параформальдегида в течение 15 мин при комнатной температуре.
3. Вымойте клетки сразу с PBS ^{2 +} и оставить в PBS ^{2 +} в течение 5 мин.
4. Инкубируйте клетки в блокировании / пермеабилизации буфера (BPB) (2% [вес / объем] БСА, 0,4% [вес / объем] сапонина в PBS ^{2 +)} с 10% [об / об] козу сыворотки. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре.
5. Развести первичных антител для обнаружения выразил Раб ГТФ, в этом примере анти-V5 (мышиное моноклональное антитело IgG _2а, Invitrogen), 1:200 в BPB. Спиновые разбавленного антитела в микроцентрифужных Эппендорф в течение 10 мин при 13000 оборотах в минуту. Место 30 мкл раствора антител на чистую парафильмом помещен в мокрой камеры. Место клеток на фильтре с ног на голову на антитела падение и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
6. Место клетки обратно (правой стороной вверх) в 12-луночного планшета и промыть 5 раз в течение 30 минут с BPB при комнатной температуре.
7. Развести соответствующие вторичные антитела, в данном случае антимышиного IgG ₁ Alexa 594-меченых (для VSVG обнаружения на поверхности, Invitrogen), и Cy5 меченых вторичных антител для распознавания вашего Раб ГТФ, в этом примере антимышиного IgG _2а Cy5 меченных (Jackson ImmunoResearch), 1:200 в BPB и спин, что и выше. Место 30 мкл раствора антител на чистую парафильмом в мокрую камеру и поместить клетки на фильтр вверх дном на антитела капли. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре.
8. Повторите шаг 4.6.
9. Dip клеток на фильтре 3X в деионизированной воды и место тIGHT стороной вверх на microslides. Добавить 10-15 мкл горы (10% [вес / объем] DABCO, 50% [вес / объем] глицерина в дистиллированной воде) в верхней части клетки. Место 18x18 мм микро покровного стекла на вершине и использованием тканей лица слегка нажмите на микро стеклянной крышкой на клетки. Печать с лаком для ногтей.
10. Анализ образцов с конфокальной микроскопии. Мы использовали микросистемная LSM 510, объективом Carl Zeiss MicroImaging, Inc, которая была оснащена 63x объектив погружением в воду.
11. Для подготовки цифры, настраивать и комбинировать изображения с помощью таких программ, как Adobe Photoshop и Adobe Illustrator.

5. Представитель Результаты

Примеры того, как коэкспрессией малого ГТФаз мешает VSVG сортировки просьба ссылаться на опубликованные статьи или для апикальной missorting ^{3, 4} или ингибирование поверхности доставки ^7.

Рисунок 1. В макете инъекции, то есть введение только плазмиды, кодирующей VSVGts045-GFP, белка доставляется базолатеральной поверхности хорошо поляризованного MDCK клетках можно судить по поверхности окраски (красные, Рисунок 1). Обратите внимание, что не все VSVGts045-GFP доставляется базолатеральной мембраны во время погони на 31 ° C, о чем свидетельствует обширная внутриклеточный сигнал для общего белка (в зеленом, рисунках 1 и В). В клетках, которые не так-поляризованного VSVGts045-GFP будет поставляться также на апикальной мембране (рис. 1 б). Если ваши образцы контроль выглядеть ячейки на рисунке 1 В, вы не можете доверять свои данные и придется повторить эксперимент с более-поляризованных клеток. Шкала баров 5 мкм.

Обсуждение

Наиболее важных шагов для успешного эксперимента микроинъекции являются качество и чистоту ДНК и полярность ваших клеток. Без поляризованных клеток, инъекции ваш контроль будет уже mistargeted VSVG и эксперимент не может быть использован. Если ДНК имеет низкое качество, ДНК может засорить инъекционной иглой, ведущих к бедным или нет выражение нужный белок вообще. Кроме того, желательно, по выражению плазмиды, которые, как известно, приводит к высокому уровню выражения, такие как pRKV.

Если в...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Axiovert 200 Микроскоп с подогревом этапе	Carl Zeiss Inc	Индивидуальный заказ
Injectman Ni2 Femtojet микроманипулятора	Эппендорф	Индивидуальный заказ
Femtotips II (Микроинъекция иглы)	Эппендорф	930000043
Microloader советы	Эппендорф	930001007
Открытый 12-мм transwell фильтр поддерживает	Corning Costar	3460
Эндотоксина без плазмиды комплект maxiprep	Sigma-Aldrich	NA0400