$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Эпителиальные клетки поляризуют свою плазматическую мембрану на биохимически и функционально различные апикальные и базолатеральные домены, где апикальный домен обращен к "свободным" поверхностям, а базолатеральная мембрана находится в контакте с субстратом и соседними клетками. Оба мембранных домена разделены плотными соединениями, которые образуют диффузионный барьер. Апикально-базолатеральная поляризация может быть успешно повторена в культуре, когда эпителиальные клетки, такие как клетки собачьей почки Мадина-Дарби (MDCK), высевают с высокой плотностью на поликарбонатных фильтрах и культивируют в течение нескольких дней 1 2. Установление и поддержание полярности клеток регулируется массивом малых ГТФаз надсемейства Ras, таких как RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 и Rab13 3 4 5 6 7. Как и все ГТФазы, эти белки циклически переключаются между неактивным состоянием, связанным с GDP, и активным состоянием, связанным с GTP. Специфические мутации в областях связывания нуклеотидов препятствуют этому циклу 8. Например, Rab13T22N навсегда заблокирован в форме GDP и, таким образом, назван «доминирующим отрицательным», в то время как Rab13Q67L больше не может гидролизовать ГТФ и, таким образом, находится в «доминирующем активном» состоянии. Для анализа их функции в клетках как доминантные, отрицательные, так и доминантные активные аллели ГТФаз обычно экспрессируются на высоких уровнях, что препятствует функции эндогенных белков 9. Элегантным способом достижения высокого уровня гиперэкспрессии за короткий промежуток времени является введение плазмид, кодирующих соответствующие белки, непосредственно в ядра поляризованных клеток, выращенных на фильтрующих носителях, с помощью техники микроинъекций. Это часто сочетается с совместной инъекцией репортерных плазмид, которые кодируют рецепторы плазматической мембраны, специфически отсортированные к апикальному или базолатеральному домену. Грузом, часто используемым для анализа сортировки груза до базолатерального домена, является чувствительный к температуре аллель гликопротеина вируса везикулярного стоматита (VSVGts045) 10. Этот белок не может правильно сворачиваться при 39°C и, таким образом, будет сохраняться в эндоплазматическом ретикулуме (ER), в то время как представляющий интерес регуляторный белок собирается в цитозоле. Сдвиг до 31°C позволит VSVGts045 правильно сложиться, покинуть ER и переместиться к плазматической мембране 11. Это преследование обычно выполняется в присутствии циклогексимида для предотвращения дальнейшего синтеза белка, что приводит к более чистым результатам. Здесь мы подробно опишем процедуру микроинъекции плазмид в поляризованные клетки и последующую инкубацию, включая температурные сдвиги, которые позволяют провести всесторонний анализ регуляторных белков, участвующих в базолатеральной сортировке.