Методическая статья

Подготовка и использование инфицированных ВИЧ-1 Первичная CD4 + Т-клеток в качестве клеток-мишеней в естественных киллеров сотовый Цитотоксические Анализы

27.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2668

⸱

14 марта 2011 г.

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, Rush University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Цитотоксичности для измерения естественных киллеров ячейки литической борьбе с ВИЧ-инфицированные клетки ограничена чистотой клеток-мишеней. Мы демонстрируем здесь изоляции высокой степени очистки населения ВИЧ-1-инфицированных первичных Т-клеточных взрывов, воспользовавшись способностью ВИЧ-1 с до нижнего модулировать CD4.

Аннотация

Натуральные киллеры (NK-клетки) являются жизненно важным компонентом врожденного иммунного ответа на вирусно-инфицированные клетки. Важно понимать способность NK-клеток распознавать и лизировать клетки, инфицированные ВИЧ-1, так как выявление любых отклонений в функции NK-клеток в отношении инфицированных ВИЧ клеток может потенциально привести к разработке методов терапии, усиливающих их цитолитическую активность. В анализах цитотоксичности необходимо использовать инфицированные ВИЧ первичные Т-бласты в качестве клеток-мишеней, а не инфицированные линии Т-клеток. Линии Т-клеток даже без инфекции весьма восприимчивы к лизису NK-клетками. Кроме того, необходимо использовать аутологичные первичные клетки, чтобы предотвратить несовместимость главного комплекса гистосовместимости I класса между клетками-мишенями и эффекторными клетками, которая приведет к лизису. Ранние исследования, оценивавшие цитолитические ответы NK-клеток на первичные клетки, инфицированные ВИЧ, не показали значительного уничтожения инфицированных клеток 1,2. Однако использование первичных Т-клеток, инфицированных ВИЧ-1, в качестве клеток-мишеней в функциональных анализах NK-клеток было затруднено из-за присутствия contaminating-неинфицированных клеток 3. Это нестабильное соотношение инфицированных и неинфицированных клеток приведет к вариациям в уничтожении NK-клетками между образцами, которые могут быть не связаны с вариабельностью функции NK-клеток донора. Таким образом, было бы полезно работать с очищенной популяцией инфицированных клеток, чтобы стандартизировать соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней между экспериментами 3,4. Здесь мы демонстрируем выделение высокоочищенной популяции клеток, инфицированных ВИЧ-1, используя способность ВИЧ-1 снижать экспрессию CD4 на инфицированных клетках и доступность коммерческих наборов для удаления мертвых или погибающих клеток 3-6. Очищенные инфицированные первичные Т-бласты затем могут быть использованы в качестве мишеней либо в анализе дегрануляции, либо в цитотоксическом анализе с использованием очищенных NK-клеток в качестве эффекторной популяции 5-7. Использование NK-клеток в качестве эффекторов в анализе дегрануляции позволяет оценить способность NK-клетки высвобождать литические содержимое специализированных лизосом 8, называемых «цитолитическими гранулами». Окрашивая антителами, конъюгированными с флуорохромом, против CD107a — белка лизосомальной мембраны, который экспрессируется на поверхности NK-клетки при слиянии цитолитических гранул с плазматической мембраной, — мы можем определить процент NK-клеток, которые подвергаются дегрануляции в ответ на распознавание клетки-мишени. В качестве альтернативы литическая активность NK-клеток может быть оценена в цитотоксическом анализе, который позволяет определить процент лизированных клеток-мишеней по высвобождению 51Cr изнутри клетки-мишени в присутствии NK-клеток.

Протокол

1. Изоляция по правам CD4 + Т-клеток из периферической крови (см. рисунок 1)

  1. Периферической венозной крови (от 40 до 60 мл) собирается в Vacutainer Трубки, содержащие гепарин натрия (Becton Дикенсон).
  2. Периферической крови, затем переведен из Vacutainer Трубы до 50 мл конические пробирки полистирола (20 мл крови в трубку).
  3. RosetteSep CD4 + T-Cell изоляции реагента (StemCell технологий) добавляется в 1 мл объемом не более 20 мл крови в 50 мл трубки и хорошо перемешивают.
  4. Затем смесь выдерживают при температуре 20-25 ° С в течение 20 минут.
  5. Через 20 минут, кальция и магния, свободного (CMF) фосфатным буферным раствором [PBS (Hyclone] л / 2% тепла инактивированной (56 ° С в течение 30 минут) эмбриональной телячьей сыворотки [FBS (Hyclone)] добавляется к смеси Для достижения конечного объема 40 мл.
  6. Разбавленной смеси (30 мл), затем слой поверх 15 мл лимфоцитов Средний Разделение [LSM (Cellgro)] в 50 мл свежего полистирола конических труб.
  7. 50 мл трубы затем центрифугировали при 1200 х г в течение 20 минут с вынул.
  8. 50 мл трубы удаляют из центрифуги осторожно, чтобы взаимодействие между МНК и среднего не нарушается. Клетки на границе собраны с 10 мл пипеткой и помещали в 50 мл свежего полистирола конических труб.
  9. Собрал интерфейсы разбавляют PBS т / 2% ЭТС до конечного объема 50 мл.
  10. 50 мл пробирки с разбавленным интерфейсы центрифугировали при 1200 х г в течение 10 минут с тормозом.
  11. После центрифугирования супернатанты наддува и гранулы ресуспендировали в 10 мл PBS т / 2% ЭТС.
  12. Клеточные суспензии, которые затем объединяются в один 50 мл коническую трубку и разбавляют до 50 мл PBS с ж / 2% FBS.
  13. Трубка, содержащая сводный клеточной суспензии центрифугируют при 300 х г в течение 10 минут, чтобы удалить все оставшиеся LSM.
  14. Супернатант отсасывают и гранулы затем ресуспендировали в 10 мл RPMI-1640 (Hyclone), содержащей 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина (Hyclone) и 2 мМ L-глутамина (CellGro ) (RPMI-полно) и подсчитывали использованием гемоцитометра.
  15. Концентрация очищенного CD4 + Т-клеток доводят до 3х10 6 / мл RPMI-полной.
  16. CD4 + 'с, затем стимулировали путем культивирования их anti-CD3/anti-CD28 связан с бисером [T-Cell Expansion Kit (Miltenyi Biotec)] на три бусины на ячейку отношения в течение 72 часов при 37 ° С в 5% С0 2 увлажненный инкубатора.

2. Заражение CD4 + Т-клеток с ВИЧ-1 (см. рисунок 1)

  1. Сотовые суспензии, содержащей стимулировали CD4 + T-клетки, удаляются из культуры пластины и рассчитывал использованием гемоцитометра.
  2. CD4 + T-клеток (~ 2x10 6) добавляют в 15 мл коническую трубку для использования в качестве неинфицированных контроля.
  3. Остальная часть CD4 + T-клеточной суспензии помещают в 50 мл коническую трубку для инфекции.
  4. Пробирки, содержащие CD4 + Т-клеточные суспензии центрифугируют при 300 х г в течение 10 минут и супернатант культуры всасывается.
  5. Вынужденное CD4 + Т-клеток ресуспендируют непосредственно в культуре жидкости, содержащие вирусные частицы, а затем спин-инфицированных при 1200 х г в течение 2 часов при температуре 20-25 ° C 9. Обычно мы инфицировать CD4 + Т-клеток при множественности заражения (МВД) от 5 для репликации дефицитный штамм ВИЧ (например, DHIV-3) или МВД 0,01 для репликации компетентным вирусом (например, ВИЧ-1 NL4 / 3) . Конечный объем не имеет значения, но трубы должны быть сбалансированы для центрифугирования. Polybrene (Santa Cruz) добавляется в культуральной жидкости до spinfection в конечной концентрации 10 мкг / мл.
  6. После завершения spinfection, супернатанты удаляют и клетки ресуспендировали при плотности клеток 3х10 6 / мл в RPMI-полной дополнен 100 ЕД / мл ИЛ-2. Инфицированных и неинфицированных клетках культуры в течение 72 часов, если репликация вируса некомпетентных была использована для заражения клетки или 5-7 дней, если репликация вируса компетентных была использована для заражения клетки. СМИ следует менять каждые 48 часов, в течение культуре.

3. Изоляция по правам естественных клеток-киллеров из периферической крови

  1. Периферической венозной крови (~ 100 мл) собирается из того же донора используется для изоляции CD4 + Т-клеток в Vacutainer Трубки, содержащие гепарин натрия (Becton Дикенсон).
  2. Затем кровь передается от Vacutainer Трубы в 50 мл конические пробирки в 20 мл аликвоты.
  3. Vacutainer Трубы затем промывают 8 мл CMF Хэнкс сбалансированном солевом растворе [HBSS (Hyclone)] и моет переданы 50 мл conicals containiнг 20 мл периферической крови. В результате объем в каждой 50 мл коническую составляет 35 мл.
  4. Разбавленной крови, затем слой поверх 15 мл LSM в свежем 50 мл коническую трубку и труб центрифугировали при 400 х г в течение 30 минут с вынул.
  5. Трубы осторожно удаляют из центрифуги и в результате взаимодействия между МНК и среднего собирают из каждой пробирки с использованием 10 мл пипеткой и помещали в 50 мл свежего конических труб.
  6. Клеточные суспензии, которые один раз промывали CMF HBSS (центрифугировали при 400 х г в течение 15 минут с тормозом).
  7. После первой стирки супернатанты удаляются, и в результате гранулы объединены в единый 50 мл конические и дважды промывают HBSS CMF (центрифугировали при 30 х г в течение 10 минут с тормозом), чтобы удалить все оставшиеся LSM.
  8. После последнего вымыть осадок resupended в 10 мл буфера для лизиса ACK (150 мМ NH 4 Cl, 1,0 мМ KHCO 3 и 0,1 мМ ЭДТА рН 7,3) и инкубировали при комнатной температуре (20-25 ° С) в течение 5 минут. Этот шаг необходим для того, чтобы удалить загрязнения эритроцитов из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).
  9. Через 10 мин. 40 мл PBS CMF добавляется к клеточной суспензии для того, чтобы остановить лизис реакции.
  10. Трубки с клеточной суспензии содержащей РВМС и лизированных эритроцитов затем центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
  11. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 5 мл PBS с 2% ЭТС и 2 мМ EDTA и подсчитывали использованием гемоцитометра.
  12. Естественных киллеров (NK) Затем клетки изолированы от РВМС использованием НК Kit изолятор [негативный отбор-человека (Miltenyi Biotec)] в соответствии с инструкциями производителя.
  13. Проточные от колонны собраны в 15 мл пробирки и трубы центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
  14. Супернатанты удаляются и гранулы ресуспендировали. Ресуспендировали гранулы объединены в одну трубку в общем объеме 1 мл среды Искова изменения Дульбеко [IMDM (Gibco)] с добавлением 10% АВ + тепла инактивированной (56 ° С в течение 30 минут) сыворотки крови человека (ГС) и подсчитывали с hemacytometer.
  15. Объем клеточной суспензии регулируется с IMDM w/10% HS, так что конечная плотность НК клеток 3х10 6 / мл. Суспензии клеток делится пополам. Один набор натуральных киллеров получает 200 Ед / мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-2. Другой набор клеток остается в среде без цитокинов лечения.
  16. NK клеточных культурах затем инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° C, 5% СО 2
  17. В результате NK клетки затем использованы в качестве эффекторных клеток как для анализа CD107a дегрануляции или 51 Cr релиз анализа.

4. Очистка ВИЧ-1 инфицированных клеток (см. рисунок 1)

  1. Культуры жидкости, содержащие инфицированные клетки удаляются из пластин и центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
  2. Супернатант отсасывают и гранулы ресуспендировали в 2 мл ФСБ с 2% ЭТС и 2 мМ ЭДТА и клеток рассчитывали на гемоцитометра.
  3. Зараженные клетки, которые не содержат ВИЧ-1 являются изолированными от тех, которые укрывают вирус, воспользовавшись тем, что ВИЧ-1 модулирует вниз CD4. Для этой цели CD4 положительных Комплект изоляции (Invitrogen) используется в соответствии с инструкциями производителя, за исключением, что одна-CD4 бусину на ячейку отношение используется.
  4. При снятии CD4 + T-клетки, отмершие клетки удаляются из очищенной клеточной популяции укрывательство вирусов с помощью мертвого Kit Удаление Cell (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя.
  5. Проточный следующие мертвых удаления ячейки в столбцах центрифугируют при 300 х г в течение 10 минут с тормозом. Супернатант удаляют, гранулы ресуспендировали в 1 мл RPMI-полной и ячейки учитываются.
  6. Очищенной инфицированных клеток в настоящее время готова к использованию в качестве мишеней в анализе CD107a дегрануляции или 51 Cr релиз анализа.

5. CD107a дегрануляции анализ (см. Рисунок 2)

  1. Культур НК ячейки удаляются из пластин и клеточной суспензии учитывается.
  2. Суспензий НК ячейки центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
  3. NK клетки ресуспендировали в RPMI-полной и окончательной концентрации доводят до 10 6 кл / мл.
  4. Суспензии клеток от изолированной инфицированных и неинфицированных Т-клеток, генерируемых в вышеупомянутые шаги центрифугируют при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
  5. Супернатанты удаляются и гранулы ресуспендировали в RPMI-полной в 2х10 6 кл / мл.
  6. К562 клетки используются как положительные клетки-мишени контроль, так как они очень восприимчивы к НК лизиса. Тон клетки центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом, супернатанты удаляются и гранулы ресуспендировали в RPMI-полной в 2х10 6 кл / мл
  7. В 96-V дном и пластины 100 ПДК цели и 100 мкл эффекторов добавляются в скважинах.
  8. Хорошо, содержащий 100 mcLof эффекторов и 100 мкл среды без клетки-мишени будет использоваться для неспецифической дегрануляции NK клеток.
  9. Для каждой лунки 10 mcLFITC-сопряженных анти-CD107a (BDIS) добавляется.
  10. Пластина затем центрифугировали при 20 х г в течение 2 минут с тормозом.
  11. Центрифугировали пластины инкубировали в течение 4 часов при 37 ° C и 5% СО 2.
  12. После инкубации пластина центрифугируют при 400 х г в течение 5 минут с тормозом.
  13. Супернатант удаляется из гранул.
  14. Каждая скважина затем окрашивали следующие панели флуорохромом конъюгированных антител на льду в течение 20 минут в общей сложности 100 mcLof потока буфера (PBS т / 2% ЭТС и 0,1% NaN 3)
    1. anti-CD3/14/20 [Pacific Blue-сопряженных (Biolegend)]
    2. анти-CD56 [APC (Biolegend)]
  15. После 20 минут инкубации, 200 мкл буфера потока добавляется в каждую лунку и пластину центрифугируют при 400 х г в течение 5 минут с тормозом.
  16. Потоком буфер затем тщательно атмосферный из каждой лунки, используя 2 мл аспирационной пипетки оснащен 200 кончик микропипеткой мкл, удостоверившись, чтобы не потревожить осадок.
  17. Шаг 15 и 16 повторяют еще раз.
  18. Пеллеты ресуспендировали в 200 мкл 1% параформальдегида в СЦМ PBS. Клеточные суспензии, затем переведен в потоке труб.
  19. Общий объем доводят до 300 мкл, добавив ~ 100 мкл 1% параформальдегида в СЦМ PBS в каждую пробирку.
  20. События (2х10 4), соответствующих натуральных киллеров собираются потока цитометр использованием FACS DIVA (BDIS) программное обеспечение для сбора и проанализированы с помощью потока Джо программное обеспечение (TreeStar).

6. CD107a Память стратегии (см. Рисунок 3)

  1. Одноместный ворота ячейки создаются с помощью вперед высота рассеяния (FSC-H) в зависимости от ширины разброса вперед (FSC-W) сюжета.
  2. Для участка размером в сравнении с зернистостью стороны ФСБ против рассеяния (SSC) сюжет создан на одном ворота клетки. Обычно лимфоциты обладают относительно низкой детализации и средних размеров ячейки.
  3. Клеток лимфоцитов ворот, затем нанесены на точку участок CD3/14/20 окрашенных клеток по сравнению с CD56 окрашенных клеток к воротам на NK клетки опуская моноцитов (CD14), Т-клетки (CD3) и В-клеток ( CD20).
  4. CD56 поз закрытого населения, то оценка для CD107a.
  5. NK клетки без групповых целей используется для установки ворот для того, что считается CD107a отрицательным.

7. 51 Cr выпуска анализ (см. рисунок 4)

  1. Зараженные клетки-мишени помечены 125 МТПП 51 Cr (Perkin Elmer) в saline/10 6 клеток в течение 2 часов в общей сложности 500 мкл при 37 ° С и 5% СО 2. В качестве положительного контроля 10 6 клеток К562 помечены 100 МТПП 51 Cr в течение 2 часов в общей сложности 500 мкл при 37 ° С и 5% СО 2. Общий объем доводят до 500 мкл с RPMI-полной. Объем 51 Cr добавлены к клеткам-мишеням рассчитывается здесь: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator)
  2. Хотя клетками-мишенями являются маркировка, ранее изолированные NK клетки удаляются от культуры и подсчитаны. Клеточные культуры содержащих НК клетки центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозами на.
  3. Гранулы содержащих НК клетки ресуспендировали в RPMI-полной и разбит на 3 трубы. Плотность клеток регулируется до 10 5 / мл в одной из труб 2.5x10 5 / мл во второй трубки и 5x10 5 / мл в третьей трубы.
  4. Маркированный цели клетки удаляются из инкубатора и 4,5 мл RPMI-полной добавляют в каждую пробирку. Трубы затем центрифугировали при 300 х GF или 10 минут.
  5. Супернатант сливают осторожно, чтобы не мешать гранул в контейнер для жидких радиоактивных отходов.
  6. Шаги 4 и 5 повторяются два раза больше, чтобы удалить все непоглощенной 51 Cr. Супернатанты с третьего мытья можно выбрасывать в контейнер для нерадиоактивных жидких отходов.
  7. Маркированный цели затем ресуспендировали в RPMI-полной, окончательной плотность клеток из 10 5 / мл.
  8. 100 мкл меченых цели аликвоты в лунки 96-у-дно и пластины для конечного числа ячейка 10 4 клетки-мишени / лунку.
  9. Table1 пример типичный вариант для 51 анализа выпуска Cr. Каждая группа будет сделано в трех экземплярах.
    1 2 4 5 6 7 8 9
    K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1)
    B Пользовательский интерфейс E: T (1:1) Пользовательский интерфейс E: T (1:1) Пользовательский интерфейс E: T (1:1) Пользовательский интерфейс E: T (2,5:1) Пользовательский интерфейс E: T (2,5:1) Пользовательский интерфейс E: T (2,5:1) Пользовательский интерфейс E: T (5:1) Пользовательский интерфейс E: T (5:1) Пользовательский интерфейс E: T (5:1)
    C Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (2,5:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (2,5:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (2,5:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1)
    D
    E
    F К562 спонтанного выделения К562 спонтанного выделения К562 спонтанного выделения Пользовательский интерфейс спонтанного выделения Пользовательский интерфейс спонтанного выделения Пользовательский интерфейс спонтанного выделения Инфицированных ВИЧ-1 Спонтанное выпуска Инфицированных ВИЧ-1 Спонтанное выпуска Инфицированных ВИЧ-1 Спонтанное выпуска
    G К562 Максимальный выпуска К562 Максимальный выпуска К562 Максимальный выпуска Пользовательский интерфейс Максимальная выпуска Пользовательский интерфейс Максимальная выпуска Пользовательский интерфейс Максимальная выпуска Инфицированных ВИЧ-1 выпуска Maxmum Инфицированных ВИЧ-1 выпуска Maxmum Инфицированных ВИЧ-1 выпуска Maxmum
  10. 100 ПДК выше NK клеточные суспензии добавляют в каждую лунку содержащие клетки-мишени.
  11. 100 мкл цели будут добавлены в соответствующие лунки, в которых эффекторные клетки отсутствуют для максимальной и спонтанные группы релизе. Спонтанные группы релиз инкубируют с дополнительно 100 мкл RPMI-полной.
  12. 96-луночного планшета центрифугируют при 20 х г в течение 2 минут с тормозом.
  13. Центрифугировали пластина затем инкубируют при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 4 часов.
  14. После 4-часовой инкубации 5 ПДК 1:10 разбавление эритроциты человека в RPMI-полной добавляется в каждую лунку, кроме максимального скважин релизе.
  15. 100 мкл 10% додецилсульфата натрия добавляется к максимальной скважин релизе.
  16. Пластины центрифугируют при 400 х г в течение 5 минут, чтобы гранулы клеток.
  17. 100 мкл бесклеточной супернатант собирают из каждой лунки и помещены в отдельный гамма-счетчик труб (Perkin Elmer). Трубы помещаются в 2470 Автоматический счетчик Gamma (Perkin Elmer). Размере 51 Cr, присутствующих в культуральной жидкости измеряется как импульсов в минуту от среднего показателя 2-х минутах чтения.
  18. Графы в минуту (CPM) показания образцов и контролей используются для расчета конкретных% лизиса, используя следующее уравнение:
    [(Экспериментальная CPM - средняя цена за тысячу показов спонтанной) / (средняя максимальная цена за тысячу показов - CPM означает спонтанное)] х 100

8. Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Шаги, участвующих в изоляции естественных клеток-киллеров и поколения ВИЧ-1-инфицированных клеток-мишеней из периферической крови.

Рисунок 2
Рисунок 2. Шаги, участвующих в строительстве анализа CD107a дегрануляции NK использованием клеток эффекторов и клеток К562, неинфицированным CD4 + Т-клеток и инфицированных ВИЧ-1 Т-клеток в качестве мишеней.

Рисунок 3
Рисунок 3. Проточная цитометрия-литниковой стратегии анализа дегрануляции CD107a. () Память на отдельные клетки и исключая скопления или дублеты на участке FSC-(вперед площадь разброса) против FSC-H (вперед высота разброс). (B) Одноместный ворота клетка на графике как FSC-против SSC (сторона разброс) литниковой на популяции лимфоцитов. (C) лимфоцитов ворот на графике как CD3/14/20(Т-клеток, моноцитов, В-клетки) против CD56 (NK клеток), стробирование по CD56 поз andCD3/14/20 нег населения (НК ворота). (D) Н. К. ворот на графике как CD107a против CD56 для визуализации NK клеток, которые degranulated (CD107a POS).

Рисунок 4
Рисунок 4. Шаги, участвующих в строительстве 51 Cr релиз анализа использования NK клеток эффекторов и клеток К562, неинфицированным CD4 + Т-клеток и инфицированных ВИЧ-1 Т-клеток в качестве мишеней.

Рисунок 5
Рисунок 5. Представитель результатов оценки цитотоксической реакции естественных киллеров против ВИЧ-1-инфицированных клеток. (А) НК-клеток оценивали по их способности дегрануляции без цели и в ответ на К562 элементов, первичных CD4 + Т-клеток и ВИЧ-инфицированных первичных Т-клеток по оценке процент NK-клеток, экспрессирующих поверхности CD107a. Номеров в каждом квадранте представляют процент от общего числа NK клеток. Б) НК-клетками оцениваются по их способности лизировать клеток К562, неинфицированным CD4 + Т-клеток и ВИЧ-1-инфицированных Т-клеток в 51 Анализ выпуска Cr при различных эффекторных ячейки клетки-мишени соотношения (E: T).

Обсуждение

Если все сделано правильно анализы, описанные в этом протоколе должны обеспечить репрезентативную картину НК способность клетки к дегрануляции против и лизиса инфицированных ВИЧ-1 клеток (см. рисунок 5). НК ячейки дегрануляции в ответ на ВИЧ-инфицированные клетки и НК лизис клетки ВИЧ-инфицированные клетки должно быть прямо пропорционально 10. Надежные результаты для двух НК ячейки функциональные тесты для измерения цитотоксических по борьбе с ВИЧ-инфицированные клетки зависят от изоляции высокой степени очистки НК клеток, а также высокой степени очистки населению зараженных клеток. Очистив НК-клеток и ВИЧ-1 инфицированных клеток имеют решающее значение для достижения довольно точно эффектора для клетки-мишени отношение. Кроме того, удаление омертвевших и апоптоза клеток из популяции клеток-мишеней важно до 51 Cr маркировки или инкубации с эффекторных клеток. 51 Cr могут быть усвоены клеток, которые подвергаются апоптозу, как наличие мертвых или апоптоза клеток при шаге маркировки изотопа приведет к высокой спонтанной релиза и будет искажать рассчитывается% конкретным лизиса. Более того, наличие мертвых или апоптоза клеток может вызвать НК дегрануляции клетка в результате аномально высоким уровнем экспрессии CD107a. Точные пипетки необходимо при удалении бесклеточной супернатанты следующие инкубации NK клеток и клеток-мишеней в 51 анализах Cr релиза, а различия в объеме супернатант удален из каждой параллельной также приведет к высокой стандартных отклонений. Изменения могут быть сделаны к этим протоколам оценить роль специфических рецепторов NK в запуске НК лизис клетки ВИЧ-инфицированных клеток путем инкубации эффекторов или цели до принятия совместного культуры с антагонистическими антител со специфическими рецепторами или лигандами 6,11. Цитокинов обработанных NK клеток (например, IL-2, Ил-15) могут быть использованы для оценки функциональности вынужденного киллеров 12. Кроме того, антитела зависимой цитотоксичности ячейки анализы могут быть выполнены с использованием этих протоколов. Анти-ВИЧ-антитела (например, анти-gp120) могут быть добавлены к клеткам-мишеням для признания НК ячейки низким сродством Fc рецептор CD16 13. Эти анализы, хотя и созданы для измерения НК ячейки цитотоксических по борьбе с ВИЧ-инфицированные клетки, также могут быть изменены, чтобы оценить возможности NK клеток продуцировать цитокины следующие ВИЧ-инфицированной клетки признание. Хотя мы описали в этом протоколе использование в пробирке инфицированные клетки, как клетки-мишени, мы недавно описал поколения клеток-мишеней у пациентов, инфицированных ВИЧ. Это требует изоляции CD4 + Т-клеток, затем расширение клеток в течение двух недель после стимуляции с митогены в присутствии интерлейкина-2 11. После двухнедельного периода расширения, протоколы, описанные в этой статье, используются для изоляции клеток-мишеней.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пробирки Vacutainer (с гепарином натрия)BD Biosciences367874
Набор для выделения CD4+ T-лимфоцитов RosetteSepStem Cell Technologies15062
CMF PBSHycloneSH30256.01
FBSHyclone10437-028
Среда для разделения лимфоцитовCellgro25-072-CV
RPMI-1640HycloneSH30096.01
Пенициллин / стрептомицинHycloneSV30010
L-глутаминCellgro25-005-Cl
Набор для экспансии T-лимфоцитовMiltenyi Biotec130-091-441
CMF HBSS (1x)HycloneSH30588.01
0.5M EDTA46-034-Cl
Набор для негативного выделения NK-клетокMiltenyi Biotec130-092-657
IMDMGIBCO, by Life Technologies12440-046
Набор для позитивного выделения CD4+Invitrogen113.31D
Набор для удаления мертвых клетокMiltenyi Biotec130-090-101
ПолибренSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-134220
CD3 PacificBlueBD Biosciences558117
CD14 PacificBlueBiolegend325616
CD20 PacificBlueBiolegend302328
CD56 APCBiolegend318310
CD69 PEBD Biosciences555531
CD107a FITCBD Biosciences555800
51ХромPerkinElmer, Inc.NEZ030002MC
Пробирки для гамма-счетчикаPerkinElmer, Inc.1270-401
Автоматический гамма-счетчик 2470PerkinElmer, Inc.2470-0050
FACS DivaBD Biosciences643629
FlowJoTree Star, Inc.FJ-9-1YR

Ссылки

  1. Ruscetti, F. W. Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells. J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).
  2. Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets. J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).
  3. Ferrari, G. Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).
  4. Shankar, P. Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection. Blood. 96, 3094-3101 (2000).
  5. Ward, J. HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response. PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).
  6. Ward, J. HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts. Blood. 110, 1207-1214 (2007).
  7. Bonaparte, M. I., Barker, E. Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules. Blood. 104, 2087-2094 (2004).
  8. Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).
  9. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 74, 10074-10080 (2000).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Fogli, M. Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals. PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).
  12. Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells. J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).
  13. Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts. Aids. 18, 1769-1779 (2004).

Перепечатки и разрешения

Теги

Т-клеткиинфицированные ВИЧ-1цитотоксичность натуральных киллероввыделение CD4+ Т-клетокфлуометрический анализанализ высвобождения хрома-51анализ дегрануляцииэффекторные соотношения NK-клетокочистка первичных клетокаутологичная клеточная культурапротокол вирусного заражения
Подготовка и использование инфицированных ВИЧ-1 Первичная CD4 + Т-клеток в качестве клеток-мишеней в естественных киллеров сотовый Цитотоксические Анализы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.