$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Nicotiana benthamiana растения выращивают в контролируемой температурой ростовой камере при температуре 25 ° C. Полностью расширена здоровые листья из 3-6 недельных растения используются.
Совет: Лучшие результаты достигаются при использовании вновь возникающих листьев
1. Agrobacterium переходных протокол инфильтрация:
День 1
- Л. Б. подряд / Рифампицин (25 мкг / мл) / канамицину (100 мкг / мл) агаром с глицерином запасы Agrobacterium tumefaciens (штамм LBA4404), содержащий соответствующие векторы с ген (ы) должны быть исследованы на гибель клеток и вектор, содержащий Кассета GUS под конститутивного промотора. Всегда включайте пустую векторное управление в качестве отрицательного контроля.
- Инкубировать при 28 ° С в течение 2 дней.
День 3
- Привить 2 мл LB содержащих рифампицин (25 мкг / мл) и канамицину (100 мкг / мл) с одной колонии из каждого LB / Рифампицин / Канамицин пластины ранее прожилками.
- Инкубируйте каждую культуру, встряхивая при 28 ° С в течение 24 часов при 200 оборотов в минуту до максимальной плотности рост будет достигнут.
Совет: Clumping иногда наблюдается, в этом случае культур должны быть тщательно ресуспендировали (т.е. пипетирования вверх и вниз) перед началом работы.
День 4
- После инкубации, увеличить общий объем до 10 мл свежей LB (содержащий соответствующие антибиотики) и acetosyringone (конечная концентрация 25 мкМ).
- Инкубируйте каждую культуру, встряхивая при 28 ° С в течение еще 16 часов.
День 5
- На следующий день мыть каждую культуру в два раза, добавляя 10 мл (не добавляйте acetosyringone) инфильтрация среду (10 мМ MgSO 4 .7 H 2 O, 9 мМ MES, рН 5,6) и центрифуге при 4000 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
- После последнего шага центрифугирования, ресуспендируют каждой культуры в 5 мл среды, содержащей инфильтрации acetosyringone (100 мкМ).
- Измерить диаметр 600 нм, измерения от 0,1 до 0,9, являются приемлемыми.
Совет: OD 600 нм от столь же низко как 0,1 были использованы без проблем, однако, выше ОР может привести к более устойчивые результаты. - Инкубируйте культур в течение 3 часов, чтобы подготовить Agrobacterium культур для инфекции.
- Смешайте культур, содержащих ген (ы) должны быть проанализированы и отрицательного контроля (Agrobacterium содержащих пустой вектор) в соотношении 1:1 с культурой содержащие кассеты GUS.
- Проникнуть абаксиальный (под) сторона вновь возникающих листьев использованием 1 мл без иглы шприца (рис. 1).
Совет: Проникнуть как отрицательные смеси управления (пустой вектор + кассета GUS) и смесь, содержащую ген быть проанализированы (ген GUS х + кассета) на противоположных листьев того же растения. Использование трех экземплярах растения для каждой процедуры. - 3-х дней после проникновения акцизного проникли листья и тест для экспрессии белка GUS.
2. Гистохимические анализа GUS
День 8
- Вакуумные проникнуть X-Gluc подложки среды в вырезали листьев.
- Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение ночи или до синего окрашивания различных появляется.
День 9
- Промыть в дистиллированной воде.
- Инкубируйте в 70% этанола до хлорофилла удаляется, затем трансфер в дистиллированную воду. Визуально оценить уровни GUS выражения.
3. Флуорометрические анализа MUG:
День 8
- Изолировать общего белка путем измельчения проникли дисков листьев в ступке с помощью жидкого азота. Добавить 100 мкл буфера GUS добыча (50 мМ Напи рН 7,0, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Тритон Х-100, 0,1% N-lauroylsarcosine натриевой соли, β-меркаптоэтанол (0,7 мкл / мл), сохраняя при этом образцы на льду.
- Центрифуга подвески при 14000 г в течение 5 мин при 4 ° С и принимать супернатант как общее растворимого белка.
- Мера концентрации, пользуясь nanodrop в соответствии с инструкциями производителя.
- Отрегулируйте концентрации белка до 100 мкг от общего растворимого белка для каждого образца с помощью GUS буфера для экстракции.
- Добавить MUG подложке (4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида тригидрат), подготовленный в буфер извлечения GUS в конечной концентрации 2 мМ. Общий объем 100 мкл каждой пробы (белок + MUG подложки) должно быть достаточно.
- Инкубируйте реакции в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
- Остановить реакцию добавлением 800 мкл стоп GUS буфере (0,2 М Na 2 CO 3).
- Мера флуоресценции с помощью ридер на длине волны возбуждения 365 нм и длине волны излучения 455 нм и сравнить значения MU стандартной кривой. Доклад уровни активности GUS как нмоль MU / мкг общего растворимого белка / мин.
4. Акции и решения:
- Acetosyringone (1 М), акции (FW = 196,2 г)
- Канамицину (100 мг / мл), акции - подготовить в дН 2 0 - фильтр стерилизовать
- Рифампицин (25 мг / мл), акции - подготовить в ДМСО
- Лурия-Бертани (LB) жидких питательных сред: (1L)
1% (м / о) Бакто-триптон, 10 г
0,5% (м / о) Бакто-дрожжевого экстракта, 5 г
170 мМ хлорида натрия 10 г
рН - 7 - Acetosyringone (25 мкМ) = 25 мкл 1 М складе в конечном объеме 1 мл
- Проникновение Medium: (1L)
10 мМ MgSO 4 0,7 дН 2 0 (FW = 246,48 г), 2,4648 г
9 мМ MES (FW = 213,25 г), 1,91925 г
рН - 5,6 - Acetosyringone (100 мкМ) = 100 мкл 1М складе в конечном объеме 1 мл
- GUS буфера для экстракции
50 мМ Напи рН 7,0, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Тритон Х-100, 0,1% N-lauroylsarcosine натриевой соли, β-меркаптоэтанол (0,7 мкл / мл) - 2x Фосфатный буфер
0,2 М NaH 2 PO 4 и 0,2 М Na 2 HPO 4 рН 7 - X-Gluc раствора субстрата
Растворите 1 мг 5-бром-4-хлор-3-индолил BD-глюкуронида (X-Gluc) в 0,1 мл метанола. Добавить 1 мл 2 раза фосфатного буфера, 20 мкл 0,1 М калий феррицианида, 10 мкл тритона Х-100 10% и 850 мкл дистиллированной воды.
5. Представитель результаты:
После этого протокола, потеря выражение GUS, как ожидается, когда гибель клеток происходит. Мы одновременно выразил ген-репортер, β-глюкуронидазы (GUS) с одним из членов цито-защитной Arabidopsis Bcl-2 Связанные athanoGene (BAG) семьи. Мы сотрудничаем проникли Н. benthamiana листья с 35S приводом кассеты выражение BAG и GUS вектор pCAMBIA 2301 использованием Agrobacterium штамм LBA4404. Как показано на рисунке 2, видимое увеличение окрашивания GUS наблюдалось после этого проникновения. И наоборот, когда известный проапоптическую член Bcl-2 семейство BAX был использован, выраженное снижение окрашивания GUS не наблюдалось (рис. 2). В обоих этих случаях, GUS экспрессия визуально отличаются по сравнению с контролем. Однако, когда разница в выражении менее очевидно, флуорометрические анализов MUG могут быть выполнены, чтобы quanitate GUS выражения.
Рисунок 1. Пример Agrobacterium смесь инфильтрации абаксиальный стороны Н. benthamiana листьев использованием 1 мл без иглы шприца.
Рисунок 2. Вектор GUS была совместно выражается в Н. benthamiana листья против смертной ген, и известный индуктор гибели клеток. GUS уровни по сравнению с пустыми векторное управление (ГСУ контроля).