Method Article

Определение концентрации нуклеиновых кислот и белков Использование Micro объемом Био-спецификации Nano Спектрофотометр

DOI:

10.3791/2699

⸱

February 17th, 2011

1Shimadzu, Scientific Instruments

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное сообщение представляет данные о точности и воспроизводимости BioSpec-нано UV-VIS спектрофотометр для двухцепочечной ДНК и белков количественного определения. Даже с ультра-малых объемов (от 1 до 2 л), воспроизводимость отлично, в то время как автоматизированные вытирая функция повышает пропускную способность и приводит к минимальным переносом на более точные результаты.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нуклеиновых кислот процедуры количественного продвинулись значительно в последние три десятилетия. Все больше и больше, молекулярные биологи требуют последовательного небольшого объема анализа нуклеиновых кислот для своих экспериментов. BioSpec-нано обеспечивает потенциальное решение проблемы неточной, не воспроизводимые результаты, присущие современные методы количественного ДНК, через специализированные оптика и чувствительные PDA детектор. BioSpec-нано также автоматизированных функций, таких, что монтаж, измерения и очистка осуществляются при помощи инструментов, что позволит устранить утомительные, повторяющиеся и непоследовательной размещения волоконно-оптических элементов и ручной очистки.

В данном исследовании представлены данные по количественному определению ДНК и белка, а также на воспроизводимость и точность измерений. Автоматизированная контакта образца и быстрого сканирования позволяет измерения в три секунды, в результате отличной пропускной способностью. Анализ данных осуществляется с помощью встроенных функций программного обеспечения. Формула для расчета концентрации ДНК является:

Пример Концентрация = DF · (OD260-OD320) · NACF (1)

Если DF = коэффициент разбавления образца и NACF = коэффициент концентрации нуклеиновых кислот.

Нуклеиновых кислот коэффициент концентрации устанавливается в соответствии с выбранным аналита 1.

Результаты Концентрация белка могут быть выражены в мкг / мл или моль / л, введя e280 и молекулярной значения веса соответственно. Когда остаток значения для Tyr, Trp и цистеина (SS связь) вводятся в e280Calc вкладке значения коэффициента экстинкции рассчитываются как e280 = 5500 х (Trp остатков) + 1490 х (Tyr остатков) + 125 х (цистеин SS связь) . E280 значение используется программное обеспечение для расчета концентрации.

В дополнение к определению концентрации нуклеиновых кислот и белка, BioSpec-нано может быть использован как ультра микро-объема спектрофотометр для многих других аналитов или в качестве стандартного спектрофотометра с использованием 5 мм длина пути клетки.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Порядок ДНК Количественный

  1. Включите инструмент.
  2. Открытое BioSpec-нано программное обеспечение от настольных ПК.
  3. Нажмите на Простой нуклеиновых кислот-дц вкладке (рис. 1).
  4. Программное обеспечение будет установить связь с инструментом и запустить последовательность инициализации. Это подтверждает, что прибор выполняет в соответствии со спецификациями.
  5. Выберите 0,7 или 0,2 мм на длина пути слайдера. Выбирается длина пути, и все расчеты основаны на выбранной длина пути.
  6. Далее в BioSpec-нано программного обеспечения нажмите кнопку Setup-Autowiping установки. Выберите 1 или 2.
  7. Внесите 2 мкл (для 0,7 мм) H 2 O или буфер на пьедестале.
  8. Нажмите пустой или F6 для пустых измерения. Каждый раз, когда новая длина пути выбран необходимо для записи пустым.
  9. Внесите 2 мкл образца на пьедестале.
  10. Нажмите кнопку Пуск в программном обеспечении или нажать кнопку запуска инструмента. Верхние окна движется в контакт с образцом капли. Ксеноновые вспышки могут быть соблюдены.
  11. Повторите тот же образец в 3 раза, чтобы определить воспроизводимость.
  12. Все данные, записанные сохраняется как. Бутон файл.
  13. Чтобы сохранить в виде файла. PDF или. CSV-файла нажмите Сохранить PDF / CSV или F9. Результаты могут быть сохранены в виде файла. CSV-файл, используя соответствующий выбор в закладке сохранить.

2. Протокол белка Количественный

  1. Выберите закладку белка Количественный (рис. 2).
  2. Введите e280 коэффициент экстинкции, если они известны.
  3. Если e280 не известно, вычислить его с помощью e280Calc.
  4. Выберите 0,7 или 0,2 мм на длина пути слайдера.
  5. Нажмите кнопку Setup-Autowiping установки. Выберите 2 или выше.
  6. Внести 3 мкл (для 0,2 мм) H 2 O или буфер на пьедестале.
  7. Нажмите пустой или F6 для пустых измерения.
  8. Внести 3 мкл белка образца на пьедестал.
  9. Нажмите кнопку Пуск в программном обеспечении или нажать кнопку запуска инструмента.
  10. Повторите тот же образец в 3 раза, чтобы определить воспроизводимость.
  11. Все данные, записанные сохраняется как. Бутон файл
  12. Чтобы сохранить в виде файла. PDF или. CSV-файла нажмите Сохранить PDF / CSV или F9.

3. Представитель Результаты:

1. Результаты ДНК Количественный

На рисунке 3 приведены данные по измерениям на типичном образце двухцепочечной ДНК. Концентрации и OD 260/280, рассчитанное также показаны. Рисунок 4 содержит воспроизводимость результатов испытаний для ДНК количественного определения. Данные на рисунках 3 и 4 показаны результаты высокой воспроизводимостью, как видно из низкой относительной стандартным отклонением 0,26%.

Примечание 1:

Неточность в ДНК количественного может возникнуть в результате наличия буфера компоненты, которые могут поглощать в УФ-области. Необходимо также использовать гомогенного раствора образца. Так как количество пробы пипеткой только 1-2 мкл, осторожно пипеткой точных объемах без введения каких-либо пузырьки не требуется.

2. Результаты белка Количественный

Рисунок 5 представляет концентрация белка для анализа BSA. Мкг / мл, концентрация белка основана на e280 значение. На рисунке 6 показана воспроизводимость анализа. Как видно из относительное стандартное отклонение 0,51%, что BioSpec-нано меры концентрации точно - не только ДНК, но и для белков.

Примечание 2: Факторы, влияющие на концентрацию белка

Точное определение концентрации белка возможно когда Есть минимальный эффект от нестабильности, вызванной рН, буферами, температуры или добавок. Большинство очищенный белок проходит через различные шаги обработки, поэтому не исключено, что белок может содержать поверхностно-активные вещества или другие добавки, которые могут помешать образования капель. Для таких образцов, используя 5 мм длина пути кварцевой кювете настоятельно рекомендуется.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Аналит окно выбора для двухцепочечной ДНК количественного

figure-protocol-2
Рисунок 2. Аналит окно выбора для не меченых белков количественного

figure-protocol-3
Рисунок 3. Репрезентативные данные для ДНК количественного

figure-protocol-4
Рисунок 4. Воспроизводимость данных для ДНК количественного

figure-protocol-5
Рисунок 5. Репрезентативные данные для белка количественного

"Рисунок Рисунок 6. Воспроизводимость данных для белков количественного

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioSpec-нано был спроектирован, чтобы решить текущие проблемы, присущие методы количественного ДНК, таких как противоречивые результаты и утомительный ручной труд. Каждое измерение занимает всего 3 секунды, позволяя опытным молекулярный биолог, чтобы проанализировать около 3-6 нескольких проб в минуту. Уникальная особенность стеклоочистителя не только повышает производительность измерений, но и избавляет от необходимости ручной очистки пьедесталы, что приводит к незначительным переносом между измерениями. Кроме того, тесты, используя лишь 2 салфетки для ДНК образцов, содержащих 1000 нг / мкл, указанных переходящий менее 2 нг / мкл.

Наличие 5 клеток длина пути мм обеспечивает возможность анализировать разбавленные нуклеиновых кислот и белков образцов и расширяет возможности использования этого инструмента для других приложений.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Suja Sukumaran, кандидат является сотрудником Shimadzu, который делает прибор описаны в этой статье.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BioSpec-nanoShimadzu Corporation
теленок тимусДНК сигма-олдрич
бычья сыворотка альбуминсигма-олдрич сигма-олдрич

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).">Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).
  2. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.">Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleic Acid QuantitationProtein QuantitationMicro volume SpectrophotometerBioSpec nanoDNA ConcentrationPath Length SelectionBlank MeasurementAuto Wiping SetupReproducibility TestingConcentration Determination

Related Articles