Микрожидкостных устройств с Groove Шаблоны для изучения Сотовая Поведение

Summary

Мы опишем протокол для изготовления микрожидкостных устройств, которые могут позволить захват клеток и культуры. При таком подходе узорной микроструктур, таких как пазы внутри микрожидкостных каналов используются для создания низкого напряжения сдвига регионов, в которых клетка может дока.

Abstract

Мы описываем микрожидкостных устройств с microgrooved моделей для изучения сотовой поведения. Это микрожидкостных платформа состоит из верхней жидкостный канал и нижней microgrooved подложки. Для изготовления microgrooved каналов, топ поли (диметилсилоксана) (PDMS) плесень содержащие впечатление микрожидкостных каналов, был согласован и связан с microgrooved подложки. С помощью этого устройства, клеток фибробластов мыши не могли двигаться и рисунком в microgrooved субстраты (25, 50, 75 и 100 мкм в ширину). Для изучения апоптоза в микрожидкостных устройств, сред, содержащих перекись водорода, Аннексин V, и пропидий иодида перфузии в жидкостный канал на 2 часа. Мы обнаружили, что клетки подвергаются окислительному стрессу стал апоптоза. Эти апоптотических клеток были подтверждены Аннексин V которая привязана к фосфатидилсерина в наружный листок из плазматической мембраны в процессе апоптоза процесса. С помощью этого устройства с микрожидкостных microgrooved узоры, апоптоз процесс наблюдался в режиме реального времени и проанализированы с помощью инвертированного микроскопа, содержащая камеру инкубации (37 ° C, 5% СО _2). Таким образом, этот микрожидкостных устройство, установленное с microgrooved подложки могут быть полезны для изучения клеточного поведения и выполнения высокой пропускной скрининга препаратов.

Protocol

А. микротехнологий из микрожидкостных устройств

1. 4-дюймовый пластины кремния обрабатывают реактивные кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
2. Отрицательные фоторезиста (ГУ-8 2015 года, Microchem, MA) является спин-покрытие в 900 оборотов в минуту в течение 1 мин на пластины кремния.
3. Пластины мягкой запеченный при температуре 95 ° С в течение 6 мин на плиту и подвергается воздействию ультрафиолетового излучения (200 Вт) в течение 4 мин через маску пленку, содержащую микроканалов.
4. Пластины сообщение запеченный при температуре 95 ° С в течение 6 мин и разработан с использованием SU-8 фоторезиста разработчика.
5. Фоторезиста узорной пластины содержащей микроканалов помещается в Петри-блюдо.
6. Поли (диметилсилоксана) (PDMS) (Sylgard 184) формы изготавливаются путем смешивания эластомера силикона и отвердителя (10:1).
7. Смесь PDMS выливают на плесень мастер Si и находится на вакуумном эксикаторе, чтобы удалить пузырьки.
8. PDMS отверждается при температуре 70 ° С в течение 1 ~ 2 часа.
9. PDMS формы, затем снимают с формы мастер Si.

Б. Сборка устройства

1. 40 мкм верхней жидкостных каналов и 40 мкм толстым дном microgrooved каналы (25, 50, 75 и 100 μ м в ширину) получаются из двух различных мастер формы Si.
2. Канал входе и выходе устройства жидкостный пробиваются.
3. Fluidic каналов и каналов микроканавка необратимо связанных с реактивной кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
4. Внеклеточного матрикса (ECM) (т.е. фибронектин) покрыты внутри микрожидкостных устройств в течение 1 часа в инкубатор (37 ° С).

С. посева клеток и экспериментальной установки

1. NIH-3T3 фибробластов мыши культивировали в колбе ткань культуры с помощью СМИ Дульбеко изменения Орла (DMEM), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
2. Клетки трипсином и диссоциирован.
3. Расхождение между клетками загружаются в микроканавка каналов на плотность клеток в 3 × 10 ^{6 кл} / мл (рис. 1).
   
   
   Рисунок 1
   
   
4. 2 мл СМИ, 100 мМ H ₂ O ₂ и апоптоз анализа (20 мкл Аннексин V и 40 мкл йодида пропидий, Invitrogen, CA), которые вливаются в канал с помощью шприцевой насос (1 мкл / мин).
5. Клетки в режиме реального времени контролировать с помощью инвертированного микроскопа (Nikon TE 2000).

Discussion

Клетки иммобилизованных и рисунком в microgrooved субстратов в микрожидкостных устройств. Процесс апоптоза клеток воздействию перекиси водорода наблюдалось в реальном времени и проанализированы с помощью Аннексин V и пропидий йодида. Таким образом, это устройство, содержащее микрожидкостных микроканавка каналов может быть полезна для высокопроизводительного скрининга препаратов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент PDMS		K.R. Anderson Co.	2065622	Поли(диметилсилоксан), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 фунта)
DMEM	medium	Invitrogen	11965	Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Media
FBS	сыворотка	Invitrogen	10082-147	Фетальная сыворотка крупного рогатого скота
Перекись водорода	Реагент	Sigma-Aldrich	H1009
Апоптоз		Invitrogen	V13242	Аннексин А, пропидий йодид
Негативный фоторезист		MicroChem Corp.	SU-8 2015
Si wafer	Tool			4-дюймовая силиконовая пластина
Реактивный кислород плазменный	реактив	Harrick Scientific Products, Inc.		обрабатывать пластину 5 мин при 30 Вт
инвертированным микроскопом	Инструмент	Nikon Instruments	TE 2000