Простой метод определения приоритетных бактериальных патогенов является использование генной инженерии репортер фага. Эти репортер фага, которые являются специфическими для их конкретных видов хозяев, способны быстро трансдуцирующих биолюминесцентного ответный сигнал к клеткам хозяина. Здесь мы опишем использование репортер фага для обнаружения Yersinia Pestis.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
"Биолюминесцентный 'Reporter Фаг для обнаружения Категория бактериальных патогенов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Yersinia pestis и Bacillus anthracis относятся к бактериальным патогенам категории А и являются возбудителями чумы и сибирской язвы соответственно 1. Хотя в настоящее время естественные случаи обоих заболеваний встречаются относительно редко, существует реальная вероятность того, что террористические группы могут использовать эти патогены в качестве биологического оружия. В связи с присущей этим болезням контагиозностью, стремительным клиническим течением и высоким уровнем смертности крайне важно быстро обнаружить вспышку. Следовательно, методики, обеспечивающие оперативное обнаружение и диагностику, имеют решающее значение для незамедлительного принятия мер в области общественного здравоохранения и активации антикризисного управления.
Рекомбинантные репортерные фаги могут обеспечить быстрый и специфичный подход к детектированию Y. pestis и B. anthracis. Центры по контролю и профилактике заболеваний в настоящее время используют классические анализы на фаговый лизис для подтвержденной идентификации этих бактериальных патогенов 2-4. В этих анализах используются природные фаги, которые специфичны и литичны для своих бактериальных хозяев. После ночного выращивания культивируемой бактерии в присутствии специфического фага образование бляшек (лизис бактерий) свидетельствует о положительной идентификации бактериальной мишени. Несмотря на надежность этих анализов, они имеют три недостатка: 1) они проводятся в лабораторных условиях; 2) они требуют изоляции и культивирования бактерий из предполагаемого образца; 3) их выполнение занимает 24-36 ч. Чтобы решить эти проблемы, были генетически сконструированы рекомбинантные репортерные фаги с «световой меткой» путем интеграции генов Vibrio harveyi luxAB в геном специфических фагов к Y. pestis и B. anthracis 5-8. Полученные репортерные фаги luxAB смогли обнаруживать свою специфическую мишень, быстро (в течение нескольких минут) и чувствительно придавая реципиентным клеткам биолюминесцентный фенотип. Важно, что детектирование осуществлялось как с культивируемыми реципиентными клетками, так и с имитационными инфицированными клиническими образцами 7.
В демонстрационных целях здесь приводится описание метода фаг-опосредованного обнаружения известного изолята Y. pestis с использованием репортерного фага luxAB, сконструированного на основе диагностического фага чумы ΦA1122 из CDC 6,7 (Рисунок 1). Аналогичный метод с небольшими модификациями (например, изменением температуры культивирования и состава сред) может быть использован для обнаружения изолятов B. anthracis с помощью репортерного фага B. anthracis Wβ::luxAB 8. Данный метод основан на фаг-опосредованной трансдукции биолюминесцентного фенотипа в культивируемые клетки Y. pestis, уровень которой затем измеряют с помощью микропланшетного люминометра. Основными преимуществами этого метода по сравнению с традиционными тестами на фаговый лизис являются простота использования, быстрое получение результатов и возможность одновременного тестирования нескольких образцов в формате 96-луночного микротитрационного планшета.
Рисунок 1. Схема детекции. Фаги смешивают с образцом, фаги инфицируют клетку, происходит экспрессия luxAB, и клетка начинает биолюминесцировать. Обработка образца не требуется; фаги и клетки смешивают, после чего измеряют интенсивность излучаемого света.
Протокол
1. Y. Pestis пластины прививки
- Подряд Y. Pestis A1122 (BeiResources # NR15) фондовых культур на Лурия-Бертани (LB) агар (Миллер). Использование стерильных и выполнять все Y. Pestis манипуляций в класс типа II биобезопасности кабинета. Y. Pestis A1122 является уровень биобезопасности (BSL) 2 исключены выбрать штамм агента. Ей не хватает и 75 кб пару низкокальциевой ответа (LCR) плазмиды вирулентности, и локус PGM, которые необходимы для вирулентности. Расти Y. Pestis при 28 ° С в течение 48 ч в статическом контролем температуры воздуха инкубатора. Темпы роста Y. Pestis медленно с периодом в 1,25 ч 9.
2. Y. Pestis жидких сред прививки
- Передача одного Y. Pestis колонии в стерильный 17 х 100 мм в пробирку с 2 мл LB бульоне использованием стерильной петлей прививки металла. Выберите колонии, которая приблизительно одинаковыми по размеру, свидетельствует о других колоний, и четко отделены от остальной колонии на пластине. Вихревые трубки кратко и выращивать культуры при 28 ° C в течение примерно 20 часов в инкубатор встряхивания (225 оборотов в минуту).
3. Y. Pestis результат, кроме репортера фага, и биолюминесцентного обнаружения
- Развести ночь Y. Pestis культуры 1:20 на свежий бульон LB в 50 мл сокола трубки (например, 500 мкл клеток в 9,5 мл среды) и расти при 28 ° C при встряхивании (225 оборотов в минуту). Вырасти до оптической плотности при 600 нм (600) от 0,2 достигается (около 5 ч). Активно растущие клетки являются более предпочтительными для обнаружения так как способность фагов для трансдукции биолюминесцентного ответ коррелирует с жизнеспособностью и приспособленность бактерий хозяев. Тем не менее, система обнаружения было показано, чтобы быть совместимым с клеток, полученных на всех этапах цикла роста 7.
- Создание подложки необходимо для биолюминесцентного реакции путем подготовки 2% н-деканский решение. Смешайте 200 мкл н-деканский с 9,8 мл LB бульоне. Vortex энергично в течение 5 секунд Премьер микропланшет люминометра инжектор с 2 мл 2% н-деканский решение. Предустановленные люминометра к autoinject 67 мкл деканский решение каждого микропланшета хорошо, а затем сразу же читать образца в течение 10 с
- Внесите 1 мл аликвоты LB бульоне на 3 трубы культуры. Добавьте 20 мкл фондовом репортер фага решение (запас 5 х 10 9 бляшкообразующих единиц [PFU] / мл) в каждую пробирку; фага и средств массовой информации только образцы выступает в качестве отрицательного контроля. При отсутствии Y. Pestis клеток, добавление фага репортер не должен вызывать биолюминесцентного отклика.
- Внесите 1 мл аликвоты Y. Pestis культуры (с шагом 3,1) на 6 труб культуры. Добавьте 20 мкл фондовом фага репортера по 3 из культур (тест-культур). Остальные 3 культур служить "клеток одиночку" отрицательный контроль (фон autobioluminescence). Смешайте культур вортексе кратко, и урожай 200 мкл из каждого образца (на данный момент 0 чтение) и обойтись в белый 96-луночного планшета. Инкубируйте остальные культуры при 28 ° C при встряхивании (225 оборотов в минуту).
- Мера времени 0 образцы для биолюминесценции (относительные световые единицы, РГ), используя планшет люминометра.
- Урожай 200 мкл каждого образца после 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин после репортер фага Кроме того, и измерять образец для биолюминесценции. Если Y. Pestis клетки присутствуют, репортер фага будет специфически связываться с клетки, вводят его ДНК, а также использовать хостов транскрипции и трансляции машины, чтобы расшифровать и перевести luxAB гены репортера (рис. 1).
- Сила сигнала и сигналов времени ответа пропорциональна числу клеток присутствует. При высоких концентрациях клеток (10 5 -10 8 КОЕ / мл), значительное увеличение РГ сравнению с контрольной группой должны быть очевидны в течение 20 мин. При более низких концентрациях клетки, (10 2 -10 4 КОЕ / мл), значительное увеличение РГ должны быть очевидны в течение 40-60 мин.
- Кроме того, для ускорения процесса обнаружения без необходимости Y. Pestis нарост, из колонии только что выросли пластина может быть смешанной (по вортексе) непосредственно в 1,5 мл Eppendorf трубка с 200 мкл LB бульоне укрывательство репортер фага. Внесите клеток / фага смесь в лунку планшет. Инкубируйте планшет при 28 ° C и читать образец для биолюминесценции через 60 мин (в одной точке времени только).
4. Представитель результаты:
Представитель эксперимента конечно время репортер фага опосредованного обнаружения Y. Pestis изображен на рисунке 2. Отрицательного контроля: 1) фага в одиночку (нет клеток), или 2) клетки в одиночку (не фага) базовых уровней по биолюминесценции около 20 РГ протяжении 60 мин вклubation (базовые уровни люминометра специфические). С другой стороны, увеличение биолюминесценции для испытания образцов (фаг репортер и клеток) очевидна на 15 минут после того фага. Сигнала должна возрастать более чем на 60 мин. Инкубацию в течение длительного периода времени (более 80 мин), приведет к сигнал, который будет снижаться по сравнению с пиковым сигнала из-за фага опосредованный лизис клеток-хозяев. Аналогичные результаты получены при инкубации температуре 37 ° С, хотя оптимальная температура для Y. Pestis роста составляет 28 ° C 9.
Рисунок 2. Фаг-опосредованной биолюминесцентного выявления Y. Pestis. В момент времени 0, фаг репортер и клетки были смешаны, инкубировали при 28 ° C, и биолюминесценции (РГ) было наблюдать во времени. Значительное увеличение РГ (* Студенты т-тест, р <0,05), очевидно, в течение 15 мин.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод демонстрирует способность репортер фага для оперативного выявления Y. Pestis с репортером фага может преобразовывать биолюминесцентного ответный сигнал, культурный Y. Pestis клетки в течение 20 минут после того фага. Репортер фага также способен непосредственно обнаружения Y. Pestis в клинической матриц, без условием выделения и последующего культивирования 7. По сравнению с стандартными фага лизис анализов, которые обычно требуют 48 часов для завершения, это значительно ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Это исследование было поддержано малого бизнеса инновационных исследований программы Национального института здоровья (NIAID, 1R43AI082698-01) и Министерства сельского хозяйства США Национального института сельского хозяйства и продовольствия (НИФА, 2009-33610-20028).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | |
| Difco LB-агар, Миллер | VWR | 90003-346 | |
| Difco LB бульоне, Миллер | VWR | 90003-350 | |
| 17 х 100 мм трубы культуры | США Научная | 1485-0810 | |
| н-деканский | Сигма | D7384 | |
| Veritas микропланшет люминометра | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite микротитровальных 96-луночного планшета | VWR | 62402-984 |
Ссылки
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).
- , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
