Мы представляем метод хроматин иммунопреципитации из спинных ганглиев ткани корневой следующие аксонального травмы. Подход может быть использован для определения конкретных сайтов связывания транскрипционных факторов и эпигенетические модификации гистонов и ДНК важны для регенерации аксонов ранения в обоих периферической и центральной нервной системы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Хроматин Иммунопреципитация из ткани спинного Ganglia Корневая следующие аксональное повреждение
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аксоны в центральной нервной системе (ЦНС) не восстанавливаются в то время как в периферической нервной системы (ПНС) не регенерировать в ограниченном объеме после травмы (Дэн и соавт., 2006). Следует признать, что транскрипционный программы необходимы для аксонов и аксонального результатом активизируются после травмы в ПНС (Makwana и соавт., 2005). Однако инструменты, доступные для анализа нейронной регуляции генов в естественных условиях ограничено и часто сложной задачей.
Спинных ганглиев корня (DRG) предлагают отличные модели системы травм, так как ЦНС и ПНС иннервируются раздвоенный аксон происходящей из той же сомы. Ганглии представляют собой дискретные коллекция клеточных тел, где все транскрипционные события происходят, и тем самым обеспечить четкое определение области транскрипционной активности, которые можно легко и воспроизводимо удалены от животного. Повреждение нервных волокон в ПНС (например, седалищного нерва), где аксонального регенерация происходит, должно выявить набор транскрипционных программы, отличные от тех, отвечая на аналогичный травмы в ЦНС, где регенерации не происходит (например, спинного мозга ). Участки для связывания транскрипционных факторов, гистонов и ДНК модификации в результате несчастного случая либо ПНС или ЦНС могут быть охарактеризованы с помощью хроматин иммунопреципитации (чип).
Здесь мы описываем ChIP протокол с использованием фиксированных тканей DRG мыши следующий аксонального травмы. Это мощное сочетание обеспечивает средства для характеристики про-хроматина регенерации среды, необходимой для продвижения аксонального регенерации.
Протокол
1. Седалищный и спинной травмы колонке нерва
- Животное помещают на хирургическое полотенце и под ним thermopad присутствует на протяжении всей процедуры поддержания температуры тела мыши при 37 ° C. Все животные под наркозом для операции с непрерывным изофлуран / O 2 администрации. Хирургические инструменты автоклаве перед процедурой.
- Для седалищного травмы, оба задних тщательно побрился, и депиляция комплектуется общим для удаления волос до чистки кожи спиртом следует Betadyne 3 раза.
- Седалищный нерв подвергается, сделав 4 мм разрез задней и параллельно бедренной кости на середине бедра через кожу и путем распространения мышц....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол обеспечивает метод прямо спросить о хроматина окружающую среду во время аксонального регенерации нервной системы взрослого следующие аксонального травмы. Она включает в себя модели DRG травмы с хроматином иммунопреципитации для исследования транскрипции и эпигенетических среду после травмы либо ПНС и ЦНС. Это особенно полезно для исследователей, которые хотели бы, чтобы охарактеризовать предполагаемые сайты связывания для своих любимых фактор транскрипции, а также определить, является ли размещение из этих.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Андреа Тедески за помощью в установлении первоначальных экспериментов чип в лабораторных и Рикко Lindner за вклад для тонкой настройки условий для чип. Эта работа была поддержана фондом Херти; Фортуна Грант, Университет Тюбингена, и DFG DI 1497/1-1 грантов (все предоставляемые Симоне ди Джованни).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент | Компания | Номер в каталоге | |
| 10x Буфер ChIP | Сотовые сигнализации | 7008 | |
| 2x буфера элюции ChIP | Сотовые сигнализации | 7009 | |
| ChIP класса Protein G магнитных шариков | Сотовые сигнализации | 9006 | |
| Magna стойку Grip (8 хорошо) | Millipore | 20-400 | |
| Хлороформ | MERCK | ООН 1888 | |
| 37% формальдегида | РОТ | CP10.1 | |
| 10x Решение Глицин | Сотовые сигнализации | 7005 | |
| Гликоген | Сигма | G1767 | |
| 10x HBSS | Гибко | 14185 | |
| Гистонов H3 антител (кролик) | Сотовые сигнализации | 2650 | |
| Нормальная Кролик IgG | Сотовые сигнализации | 2729 | |
| Фенол / хлороформ / изоамиловый спирт | РОТ | A156.1 | |
| Ингибиторы протеазы Таблетки коктейль | Roche | 04 693 116 001 | |
| Протеиназы К (20 мг / мл) | Сотовые сигнализации | 10012 | |
| SDS Лизис буфера | Северная часть штата | 20-163 |
| Необходимое оборудование |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Микроцентрифуга |
| Thermomixer |
Ссылки
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Har....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
