Мы представляем метод хроматин иммунопреципитации из спинных ганглиев ткани корневой следующие аксонального травмы. Подход может быть использован для определения конкретных сайтов связывания транскрипционных факторов и эпигенетические модификации гистонов и ДНК важны для регенерации аксонов ранения в обоих периферической и центральной нервной системы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Хроматин Иммунопреципитация из ткани спинного Ganglia Корневая следующие аксональное повреждение
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аксоны в центральной нервной системе (ЦНС) не восстанавливаются в то время как в периферической нервной системы (ПНС) не регенерировать в ограниченном объеме после травмы (Дэн и соавт., 2006). Следует признать, что транскрипционный программы необходимы для аксонов и аксонального результатом активизируются после травмы в ПНС (Makwana и соавт., 2005). Однако инструменты, доступные для анализа нейронной регуляции генов в естественных условиях ограничено и часто сложной задачей.
Спинных ганглиев корня (DRG) предлагают отличные модели системы травм, так как ЦНС и ПНС иннервируются раздвоенный аксон происходящей из той же сомы. Ганглии представляют собой дискретные коллекция клеточных тел, где все транскрипционные события происходят, и тем самым обеспечить четкое определение области транскрипционной активности, которые можно легко и воспроизводимо удалены от животного. Повреждение нервных волокон в ПНС (например, седалищного нерва), где аксонального регенерация происходит, должно выявить набор транскрипционных программы, отличные от тех, отвечая на аналогичный травмы в ЦНС, где регенерации не происходит (например, спинного мозга ). Участки для связывания транскрипционных факторов, гистонов и ДНК модификации в результате несчастного случая либо ПНС или ЦНС могут быть охарактеризованы с помощью хроматин иммунопреципитации (чип).
Здесь мы описываем ChIP протокол с использованием фиксированных тканей DRG мыши следующий аксонального травмы. Это мощное сочетание обеспечивает средства для характеристики про-хроматина регенерации среды, необходимой для продвижения аксонального регенерации.
Протокол
1. Седалищный и спинной травмы колонке нерва
- Животное помещают на хирургическое полотенце и под ним thermopad присутствует на протяжении всей процедуры поддержания температуры тела мыши при 37 ° C. Все животные под наркозом для операции с непрерывным изофлуран / O 2 администрации. Хирургические инструменты автоклаве перед процедурой.
- Для седалищного травмы, оба задних тщательно побрился, и депиляция комплектуется общим для удаления волос до чистки кожи спиртом следует Betadyne 3 раза.
- Седалищный нерв подвергается, сделав 4 мм разрез задней и параллельно бедренной кости на середине бедра через кожу и путем распространения мышцы обособленно двуглавой мышцы бедра с мелкими щипцами.
- Подвергается седалищного нерва, то травмирован, а кожа закрыта с двумя клипами шва.
ПРИМЕЧАНИЕ: тот же разрез делается, чтобы разоблачить седалищного нерва, но рана зашивается закрыты оставляя нетронутыми нервы за вред, обман.
- Для спинных травм колонка, спинка мыши тщательно побрился, и депиляция комплектуется общим для удаления волос до чистки кожи спиртом спрей / салфетки.
- Спинной мозг подвергается делая 2,5 см разрез с примерно T7 с T13. Кожа раздвинуты, и соединительную ткань, удаляется вместе с позвонком T9 на T11.
- Ламинэктомия выполняется на уровне T10
Примечание: Для большинства экспериментов, ламинэктомия считается травмы Шам.
- Несколько капель Xylocain добавляются в ткани анестезировать мозга и мозговой оболочки удаляется, обращая внимание не трогать спинного мозга.
- Спинной колонки ранения и мышцы зашивается близко, снова обращая внимание не трогать спинного мозга. Наконец, кожа зашивается закрыта с шовным клипов. Бупренорфин (0,1 мг / кг массы тела) следует назначать два раза в день в течение 48 часов или пока не нужны.
2. Перекрестное связывание
- Рассеките L4 и L5 DRG из поврежденных мышей после euthanization. Сбор общей сложности 16 DRG в ледяную HBSS + ингибиторы протеазы коктейль (2 ранены и 2 фиктивный DRG от каждого животного в общей сложности 4 животных).
- Кратко центрифуги DRG, затем осторожно удалите HBSS и добавить 500 мкл 1% формальдегида в PBS + коктейль ингибиторов протеаз и инкубировать образца в течение 30 минут при температуре 37 ° C.
Важным шагом. Используйте свежие, молекулярной биологии формальдегида класса.
- Добавить 125 мМ глицина, чтобы остановить фиксации и инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
- Кратко центрифуги, аспирата с буфером, и мыть ткани в два раза с 500 мкл ледяной PBS + коктейль ингибиторов протеаз.
3. Подготовка ядра и хроматина стрижки
- Аспирацию с PBS, добавить 400 мкл буфера для лизиса SDS, трансфер в предварительно охлажденной микроцентрифужных трубки, и нарушить ткань с примерно 30 ударов с micropestle.
Важный шаг. Лизис и нарушение ткани являются жизненно важными для хорошего урожая сшитый хроматина.
- Разрушать ультразвуком образца с 8 импульсов, 10 секунд каждый при 70% мощности (Bandelin, Sonoplus GM70).
ВНИМАНИЕ. Стрижка хроматина должна быть оптимизирована для вашего конкретного ультразвуком настройки и надлежащего фрагментации хроматина, должны быть проверены перед запуском реальном эксперименте IP (см. раздел 3).
ПРИМЕЧАНИЕ. Фрагментации хроматина, также может быть выполнена микрококковой нуклеазы (MNase) пищеварение. Как правило, фрагментации с помощью ультразвука является предпочтительным для фиксированных тканей, в то время MNase пищеварение благоприятствования для отечественных иммунопреципитации хроматина ткани. Сшитые, стриженого хроматина могут храниться при температуре -80 ° С в течение 2 месяцев, но избежать повторных циклов замораживания / оттаивания.
4. Анализ хроматина пищеварения (рекомендуется)
- Удалить 10 мкл ваш стриженой хроматина пробы для анализа. Добавьте 200 мМ NaCl в образец и обратного сшивки путем инкубации при температуре 65 ° С в течение 2 часов.
- Purify ДНК (см. раздел 8) и запустить 1% агарозном геле. ДНК должны быть фрагментированы на длину приблизительно 200-1000 п.о. (рис. 1).
ВНИМАНИЕ. Чрезмерной фрагментации хроматина может привести к снижению сигнала, в то время как неполное фрагментация приведет к снижению разрешения и более фоне.
5. Иммунопреципитация
- Определить количество иммунопреципитации реакций (см. примечание ниже), и разделить поровну на образцы новых труб. Довести объем каждойдо 500 мкл буфера с чипом + коктейль ингибиторов протеаз.
- Удалить 5 мкл разведенного образца вашей и передачи в новую трубу. Это ваш 1% входного образца и она будет храниться при температуре -20 ° С до необходимости (раздел 7).
- Для каждого иммунопреципитации, добавить соответствующие антитела или нормального контроля IgG и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи с вращением.
ПРИМЕЧАНИЕ. При определении числа иммунопреципитации, положительного контроля (например, гистонов антитело, Н3) и отрицательный контроль (нормальный IgG) должны быть рассмотрены. Количество антител, используемых для каждого IP колеблется от антител и должны быть определены эмпирически. Однако, как правило, в пределах 2-10 мкг / иммунопреципитации.
- Чтобы ваш иммунопреципитации антитело / белок / ДНК комплекс, добавить 30 мкл ChIP класса Protein G Магнитные гранулы и инкубировать в течение 2 ч при 4 ° С с вращением.
6. Мытье
- Для выпадающего связаны хроматин-бусинка комплекс, место трубки на магнитной стойке. Подождите, пока раствор не станет прозрачным, а затем осторожно удалите супернатант.
- Добавить 1 мл низкой вымыть соль (ChIP буфера) бусы и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 3-5 минут с вращением, то выпадающие бисером и аспирации от мытья, как в пункте 6.1. Повторите этот шаг для общей сложности 3 стирок.
- Добавить 1 мл промывочного буфера высокой соли (ChIP буфера + 350 мМ NaCl) на бусы и инкубировать в течение 3-5 минут с вращением, то выпадающие бисером и аспирации от мытья, как в пункте 6.1.
7. Элюирование и обратная сшивка
- Возьмите образцы входных из -20 ° С, добавить 150 мкл буфера ChIP элюции и отложите в сторону при комнатной температуре до Шаг 7.5.
- Добавить 150 мкл буфера 1x Элюирование чип для каждого IP-образец с шага 6.3.
- Место труб в thermomixer и элюировать хроматина из бисера путем инкубации образцов при 65 ° С в течение 30 минут с нежным вортексе.
- Раскрывающееся бусины на магнитной стойке, и тщательно передачи элюировали хроматина (супернатант) в новые трубы.
- Для всех труб, в том числе ваши образцы входных, добавить 200 мМ хлорида натрия и 40 мкг / реакции протеиназы К и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 2 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Элюирования шага могут быть выполнены при комнатной температуре, тоже, но это может быть не столь эффективным.
8. ДНК восстановления
- Добавьте 1 объемом фенол / хлороформ вашим образцам с шага 7.5 и вихрь в течение 30 секунд.
- Центрифуга с максимальной скоростью в микроцентрифужных при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Тщательно восстановить водный (верхний) фазы в новых трубах, добавить 1 объемом хлороформа в водной фазе, а вихрь в течение 30 секунд.
- Центрифуга с максимальной скоростью в микроцентрифужных при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Тщательно восстановить водный (верхний) фазы в новых трубах, затем добавить 300 мм NaOAc, 20 мкг / реакции гликогена, и 2,5 объемов ледяной 100% этанола.
ВНИМАНИЕ. Добавлением перевозчика, такие как гликоген, необходимо для повышения осадков относительно небольших размеров фрагментов ДНК.
- Инкубируйте при -80 ° С в течение 2 часов для осаждения ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ. Осадков шаг также может быть выполнена в течение ночи при температуре -20 ° С.
- Центрифуга образцов при максимальной скорости в микроцентрифужных в течение 20 минут при 4 ° C.
- Осторожно удалите супернатант и мыть осажденный гранулы ДНК с 300 мкл ледяной 70% этанола.
- Центрифуга образцов при максимальной скорости в микроцентрифужных в течение 10 минут при 4 ° C.
- Осторожно удалите столько супернатант это возможно, и пусть гранулы воздушно-сухой.
- Ресуспендируют в 20 мкл стерильной H 2 O. Образцы теперь готовы для ПЦР или ДНК можно хранить при температуре -20 ° C.
9. Представитель Результаты
Представитель результате ChIP эксперимент в ДРГ следующие седалищного поражения показано (рис. 1 и 2). Во-первых, мы показываем фрагментированной ДНК длиной около 200-1000 п.о. (рис. 1). Во-вторых, мы демонстрируем сигнал ПЦР следующий чип от проксимальных промоутер рост связан белок-43 (GAP-43) только после травмы седалищного нерва (переулок 4, рис. 2, 5 '). Нет сигнала ПЦР имеет место, когда животное получает травму фиктивный только (дорожка 3), а при использовании обычного IgG сыворотки для IP (дорожка 5 и 6). Для проверки специфичности антител, мы проанализировали те же образцы ДНК, но используется набор элементов управления грунтовка, которая обнаруживает региона в 3'-UTR нашей интересующего гена, где нет занятости не ожидается. ПЦР сигналы отсутствуют во всех полос (полосы 3-6, рис. 2, 3 '), за исключением входного сигнала, представляющих Стороны, IP образцы ДНК в стандартной ПЦР управления (полоса 1-2, FIGUповторно 2). Этот чип процедура может быть выполнена следующим либо седалищного или спинальной травме спинного колонки, которые обобщены в схеме (рис. 3).
Рисунок 1. Агарозном геле обратной сшитого ДНК, который был стриженый с помощью ультразвука в необходимом диапазоне длин фрагментов.
Рисунок 2. Полу-количественный ПЦР результаты DRG ткани следующие седалищного нерва поражение, показывающие, что ацетилированного p53 связывается с GAP-43 проксимальной области промотора 48 часов после повреждения седалищного нерва. Управление ПЦР из той же ткани показывают, что DRG ацетилированного р53 не связывается с контрольной области ДНК, расположенная в 3'-нетранслируемой области (УТР) от GAP-43 гена (S = Шам, I = раненых).
Рисунок 3. Общую диаграмму, показывающую расположение поражения сайтов на седалищный нерв и спинной колонки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол обеспечивает метод прямо спросить о хроматина окружающую среду во время аксонального регенерации нервной системы взрослого следующие аксонального травмы. Она включает в себя модели DRG травмы с хроматином иммунопреципитации для исследования транскрипции и эпигенетических среду после травмы либо ПНС и ЦНС. Это особенно полезно для исследователей, которые хотели бы, чтобы охарактеризовать предполагаемые сайты связывания для своих любимых фактор транскрипции, а также определить, является ли размещение из этих...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Андреа Тедески за помощью в установлении первоначальных экспериментов чип в лабораторных и Рикко Lindner за вклад для тонкой настройки условий для чип. Эта работа была поддержана фондом Херти; Фортуна Грант, Университет Тюбингена, и DFG DI 1497/1-1 грантов (все предоставляемые Симоне ди Джованни).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент | Компания | Номер в каталоге | |
| 10x Буфер ChIP | Сотовые сигнализации | 7008 | |
| 2x буфера элюции ChIP | Сотовые сигнализации | 7009 | |
| ChIP класса Protein G магнитных шариков | Сотовые сигнализации | 9006 | |
| Magna стойку Grip (8 хорошо) | Millipore | 20-400 | |
| Хлороформ | MERCK | ООН 1888 | |
| 37% формальдегида | РОТ | CP10.1 | |
| 10x Решение Глицин | Сотовые сигнализации | 7005 | |
| Гликоген | Сигма | G1767 | |
| 10x HBSS | Гибко | 14185 | |
| Гистонов H3 антител (кролик) | Сотовые сигнализации | 2650 | |
| Нормальная Кролик IgG | Сотовые сигнализации | 2729 | |
| Фенол / хлороформ / изоамиловый спирт | РОТ | A156.1 | |
| Ингибиторы протеазы Таблетки коктейль | Roche | 04 693 116 001 | |
| Протеиназы К (20 мг / мл) | Сотовые сигнализации | 10012 | |
| SDS Лизис буфера | Северная часть штата | 20-163 |
| Необходимое оборудование |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Микроцентрифуга |
| Thermomixer |
Ссылки
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
