Экономически эффективный метод для отслеживания источника микробного Использование Конкретные человека и животных вирусов

Summary

Исследование описывает эффективный метод для идентификации источника фекальных / мочи заражения или загрязнения нитратами в воде с помощью КПЦР для конкретного количественного человека / свинины / бычьей ДНК-вирусы, аденовирусы и polyomaviruses, предложил в качестве инструментов MST.

Abstract

Микробное загрязнение окружающей среды представляет значительный риск для здоровья. Классические показатели кала бактерий показали наличие существенных ограничений, вирусы более устойчивы ко многим процессам инактивации, а стандартные показатели кала не информируют об источнике загрязнения. Разработка экономически эффективных методов концентрирования вирусов на основе водных и молекулярных анализов облегчает применение вирусов в качестве индикаторов фекального загрязнения и в качестве инструментов отслеживания микробных источников (MST). Аденовирусы и полиомавирусы представляют собой ДНК-вирусы, инфицирующие определенные виды позвоночных, включая человека, и устойчиво выделяются с фекалиями и/или мочой во всех изученных географических районах. В предыдущих исследованиях мы предложили количественную оценку аденовирусов человека (HAdV) и полиомавирусов JC (JCPyV) с помощью количественной ПЦР (кПЦР) в качестве индекса фекальной контаминации человека. Недавно мы разработали методы количественной ПЦР для специфического количественного определения аденовирусов свиней (PAdV) и полиомавирусов крупного рогатого скота (BPyV) в качестве фекальных маркеров загрязнения животных с чувствительностью 1-10 копий генома на пробирку. В этом исследовании мы представляем процедуру, которой необходимо следовать для определения источника загрязнения в пробах воды с помощью этих инструментов. В качестве примера репрезентативных результатов приведен анализ вирусов в грунтовых водах с высоким содержанием нитратов.

Обнаружение вирусов в слабо или умеренно загрязненных водах требует концентрации вирусов по крайней мере из нескольких литров воды в гораздо меньший объем, процедура, которая обычно включает в себя два этапа концентрации последовательно. Эта несколько громоздкая процедура и вариабельность, наблюдаемая при выздоровлении от вируса, значительно затрудняют одновременную обработку большого количества проб воды.

Чтобы устранить узкое место, вызванное двухэтапными процедурами, мы применили одноэтапный протокол, разработанный в предыдущих исследованиях и применимый к разнообразию водных матриц. Процедура включает в себя: подкисление проб десятилитровой воды, флокуляцию обезжиренным молоком, гравитационное осаждение хлопьевидных материалов, сбор осадка и центрифугирование, ресуспендирование осадка в 10 мл фосфатного буфера. Вирусный концентрат используется для экстракции вирусных нуклеиновых кислот, а специфические аденовирусы и полиомавирусы, представляющие интерес, количественно оцениваются с помощью количественной ПЦР. С помощью этого недорогого метода концентрирования можно одновременно анализировать большое количество проб.

Процедура была применена к анализу вод для купания, морской и речной воды, и в этом исследовании мы представляем результаты анализа образцов грунтовых вод. Этот высокопроизводительный количественный метод надежен, прост и экономичен.

Protocol

1. Концентрация вирусной частицы, присутствующие в пробах воды

1. Сбор и кондиционирования проб воды
   1. Сбор минимум 2 повторов 10 л на один образец в пластиковых контейнерах с плоским дном и один дополнительный образец в качестве управления процессами. Последний пример будет подсыпали известное количество вирусных частиц и используются в качестве контроля.
      Примечание: рекомендуется иметь специальный отдельный материал (бутылки, трубы и т.д.) для шипами образцов.
   2. Проверьте калибровку conductimeter и откалибровать, если необходимо. Подготовка отрицательного контроля с использованием водопроводной воды доводят до ранее адекватной проводимос....

Discussion

Процедура, описанная выполнит условия для установки методом для рутинной окружающей среды и лаборатории общественного здравоохранения: воспроизводимый, надежный, простой и экономически эффективной. Протокол прост, однако он должен быть тщательно следили. Низкая проводимость в образцах без добавления просил концентрации искусственной морской воде солей бы резко сократить восстановления вирусов как было бы в случае, если помешивая время для флокуляции значительно снижается (менее 5 часов, например).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Высокая скорость центрифуги (8000 мкг)	Berckman Coulter	Avanti J-20XP
рН-метр, термометр и conductimeter	Afora	LPPC3003
Пластиковые трубы длиной 100-200 см	Deltalab	350059
Стерильные окончил одноразовые пипетки	Labclinics	PN10E1
Стерильные пластиковые трубы в 1,5 и 10-15 мл (Эппендорф, Соколов и др.)	Afora	KA298/00
Центрифуга горшки (500 мл)	Fisher Scientific	SE5753512
Магнитные мешалки и магниты (по одному наобразца)	Fisher Scientific	10510
Стеклянные или пластиковые контейнеры с плоским дном, чтобы разрешить использование магнитной мешалки	Deltalab	191642
Перистальтического насоса для удаления надосадочной (или водоструйный вакуумный насос)	Watson-Marlow	323E / D
Таймер на отключение шевелясь после 8-10 часов	Deltalab	900400
Соляная кислота (1н и 0,1)	Panreac	141020.1611
Гидроксид натрия (1N)	Panreac	131687.1211
Искусственные морской соли морской воды	Сигма	S9883
Обезжиренное молоко (SM)	Difco	232100
Фосфатный буфер рН = 7, 5			1:02 об. / стерильных Na 2 HPO 4 0,2 М и NaH 2 PO 4 0,2 М при рН 7,5
Тиосульфата	Panreac	121879.1209	Сделать 10% раствор в воде
QIAamp Вирусная РНК Mini Kit	Qiagen	52904
96-и оптические пластины реакции (500 единиц)	Applied Biosystems	43426659
Оптический клей охватывает (100 единиц)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan Экологическая ПЦР Master Mix 2x	Applied Biosystems	4396838