Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экономически эффективный метод для отслеживания источника микробного Использование Конкретные человека и животных вирусов

11.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2820

⸱

3 декабря 2011 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Water and Food Viral Pollution, Department of Microbiology, Faculty of Biology, University of Barcelona

В этой статье

Краткое содержание

Исследование описывает эффективный метод для идентификации источника фекальных / мочи заражения или загрязнения нитратами в воде с помощью КПЦР для конкретного количественного человека / свинины / бычьей ДНК-вирусы, аденовирусы и polyomaviruses, предложил в качестве инструментов MST.

Аннотация

Микробное загрязнение окружающей среды представляет собой значительный риск для здоровья. Классические бактериальные индикаторы фекального загрязнения имеют существенные ограничения; вирусы более устойчивы ко многим процессам инактивации, а стандартные фекальные индикаторы не позволяют определить источник загрязнения. Разработка экономически эффективных методов концентрирования вирусов из воды и молекулярных анализов способствует применению вирусов в качестве индикаторов фекального загрязнения и инструментов микробиологического отслеживания источников (MST). Аденовирусы и полиомавирусы представляют собой ДНК-вирусы, которые инфицируют определенные виды позвоночных, включая людей, и постоянно выделяются с фекалиями и/или мочой во всех исследованных географических регионах. В предыдущих исследованиях мы предлагали количественное определение человеческих аденовирусов (HAdV) и полиомавирусов JC (JCPyV) с помощью количественной ПЦР (qPCR) в качестве индекса фекального загрязнения человеческого происхождения. Недавно нами были разработаны методы qPCR для специфического количественного определения свиных аденовирусов (PAdV) и бычьих полиомавирусов (BPyV) в качестве животных фекальных маркеров загрязнения с чувствительностью 1-10 копий генома на пробирку. В данной работе мы представляем процедуру идентификации источника загрязнения в пробах воды с использованием этих инструментов. В качестве примера репрезентативных результатов представлен анализ вирусов в грунтовых водах с высоким уровнем нитратов.

Обнаружение вирусов в слабо- или умеренно загрязненных водах требует концентрирования вирусов из нескольких литров воды в гораздо меньший объем; эта процедура обычно включает два последовательных этапа концентрирования. Столь трудоемкий процесс и наблюдаемая вариабельность выхода вирусов значительно затрудняют одновременную обработку большого количества проб воды.

Для устранения ограничений, вызванных двухэтапными процедурами, мы применили одноэтапный протокол, разработанный в предыдущих исследованиях и применимый к различным водным матрицам. Процедура включает: подкисление десятилитровых проб воды, флокуляцию с помощью обезжиренного молока, гравитационное осаждение флокулированного материала, сбор осадка и центрифугирование, ресуспендирование осадка в 10 ml фосфатного буфера. Вирусный концентрат используется для экстракции вирусных нуклеиновых кислот, а количество специфических интересующих аденовирусов и полиомавирусов определяют с помощью qPCR. Данный недорогой метод концентрирования позволяет одновременно анализировать большое количество образцов.

Данная процедура применялась для анализа купальных вод, морской и речной воды, а в настоящем исследовании мы представляем результаты анализа проб грунтовых вод. Этот высокопроизводительный количественный метод является надежным, простым в исполнении и экономически эффективным.

Протокол

1. Концентрация вирусной частицы, присутствующие в пробах воды

  1. Сбор и кондиционирования проб воды
    1. Сбор минимум 2 повторов 10 л на один образец в пластиковых контейнерах с плоским дном и один дополнительный образец в качестве управления процессами. Последний пример будет подсыпали известное количество вирусных частиц и используются в качестве контроля.
      Примечание: рекомендуется иметь специальный отдельный материал (бутылки, трубы и т.д.) для шипами образцов.
    2. Проверьте калибровку conductimeter и откалибровать, если необходимо. Подготовка отрицательного контроля с использованием водопроводной воды доводят до ранее адекватной проводимости (см. ниже 1.6) в один дополнительный пластиковый контейнер 10 л.
    3. Для шипами образцов: Добавить стандартного объема контроля вируса (около 10 5 копий генома на 10 л воды) для образца. Смешайте перемешиванием избежать брызг и аэрозолей. Положительные контроля могли бы состоять в необычных штамм аденовируса суч как HAdV-35 или бактериофаги, такие как MS2.
    4. Если образец представляет высокое количество взвешенных частиц (песка или других материалов), пусть это осадков в течение 15 минут. Передача воды в новый контейнер.
    5. Отрегулируйте рН пробы воды до 3,5 (± 0,1) путем добавления 1 н HCl. Этот шаг важен для концентрации вирусов, поэтому убедитесь, что рН были должным образом закреплены. Смешайте воду тщательно интенсивном перемешивании с добавлением соляной кислоты. (Примечание: если рН ниже 3,5 добавляют 1 М NaOH).
    6. Отрегулируйте проводимости. Если образец имеет проводимость 1500 мкСм / см и выше, этот шаг не нужен. Если проводимость ниже, чем в 1500 мкСм / см образование флоккулируют материала (хлопья) не гарантируется так регулировать проводимость до 1500 мкСм / см за счет добавления искусственных морской соли (Sigma). Mix энергично перемешивают, добавляя морскими солями.
    7. Запись рН образцов до и после кондиционирования, а такжес объемом соляной кислоты используются. Проводимость должна быть записано после корректировки рН. Всегда дезинфекции рН-метр и conductimeter электродов с свежим раствором соляной кислоты, dechlorinate с 10% раствором натрия tiosulphate и, наконец, промыть дистиллированной водой.
  2. Подготовка предварительного флоккулируют 1% обезжиренное молоко (PSM)
    1. Проверка калибровки рН-метра и conductimeter и откалибровать, если необходимо.
    2. Подготовка предварительно флоккулируют обезжиренное молоко решение (1% PSM, в / о), растворив 10 г сухого обезжиренного молока (Difco) в 1 л искусственной морской воде (растворяется 33,3 г искусственной морской соли в 1 л дехлорированию водопроводной воды и автоклав) и Тщательно регулируя рН до 3,5 1н HCl. Хлопья должны быть видны. Подготовка решения непосредственно перед, которые будут использоваться или хранить при температуре 4 ° С в течение 24 ч. Для дехлорирования использовать 1 мл 10% раствора на tiosulphate 100 мл воды.
  3. Флокуляция вирусные частицы, присутствующие в пробах воды
    1. Добавить 100 мл 1% PSM к 10-Л пробы воды.
    2. Движение образцов в течение 8-10 ч, чтобы позволить вирусам адсорбироваться на хлопья. Используйте таймер на отключение помешивая через 8-10 ч.
    3. Остановите перемешивание и пусть хлопья осадка под действием силы тяжести в течение 8-10 ч.
  4. Сбор и повторное растворение хлопьев. Центрифугирование
    1. Удалить супернатант использованием перистальтического насоса и пластиковые пипетки связаны с пластиковой трубкой. Для шипами образцы супернатанта должны быть сложены в бутылку и дезинфекции в соответствии с внутренними процедурами. Во всех случаях старайтесь не собирать гранул.
    2. Сбор осадка хлопьев (около 500 мл) в центрифуге бутылку.
    3. Баланс горшки путем добавления ПСМ рН 3,5.
    4. Центрифуга горшки в высокоскоростной центрифуге при 8000 мкг в течение 30 мин при 4 ° C. Как только центрифуги останавливается, осторожно удалите центрифуги горшки из центрифуги.
    5. Очень гвидимому слейте и выбросьте супернатант. Следуйте надлежащие меры по инфекционным материалом.
    6. Добавить 7 мл фосфатного буфера для растворения гранул в каждой центрифуге бутылку.
    7. Как только хлопья были разведены, измерять и добавлять фосфатный буфер, чтобы достичь общего объема 10 мл.
    8. Однородный вирусного концентрата на вортексе и распространение 10 мл в чистые микропробирок которых должны быть заморожены при температуре -80 ° C до необходимости в дальнейшем анализе.

2. Выделения нуклеиновых кислот

  1. Выполните извлечение нуклеиновых кислот с QIAamp Вирусная РНК Mini Kit следующие инструкции производителя. Этот комплект позволяет использовать автоматизированные платформы (например, Qiacube, Qiagen).

3. Количественный ПЦР человека аденовирусы (HAdV), JC polyomaviruses (JCPyV), свиней аденовирусы (ПБНС) и бычьего polyomaviruses (BPyV)

  1. Количественная оценка геном копиями в образцах
    1. ГотовитьКПЦР смесь в чистую отдельную область с помощью TaqMan Экологическая ПЦР Master Mix 2x (Applied Biosystems). Реакция происходит в 96-и оптических реакция пластины, покрытой с оптическим охватывает клея. Концентрации Master Mix, праймеры и зонды, описаны в таблице 1.
    2. Как только смесь была подготовлена, аликвоту 15μl в каждую лунку, включая элементы управления (см. 3.2). Общий объем для одной реакции после добавления цель будет 25 мкл (15μl микс + 10 мкл образца или стандарта).
    3. Добавить нуклеиновой кислоты выписки из образцов (10 мкл) в отдельную область. Выполнить прямое и десять раз разбавления в очищенной воде каждого образца в двух экземплярах. Обложка скважин содержащих образцы с частью клей крышкой, держать другой части прикрытия для следующего шага.
    4. Добавить разведения ДНК стандартных суспензий (10 мкл) от 10 0 до 10 6 GC/10μl от трех экземплярах и использовании микропипетки исключительно для стандартастандартные ДНК. Желательно, чтобы добавить стандартов в области оснащены УФ-излучение для разрушения ДНК плазмиды и очистить микропипетки после каждого использования. Обложка скважин содержащих стандарты нарезанные клей крышкой.
      Примечание: Для подготовки стандартных суспензий, которые будут использоваться в количественной оценке геном копиями, область ДНК-мишени должны быть клонирован в плазмиду и линеаризованных. В адресу вы найдете подробные процедуры по созданию стандартных кривых плазмидой ДНК шаблоны для использования в КПЦР:
      http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf
    5. Выполните КПЦР в адекватной системы выбора соответствующих параметров (с учетом использования клея покрытия и общий объем в каждой лунке, и т.д.). После активации Золотой AmpliTaq течение 10 мин при 95 ° C, 40 циклов амплификации осуществляется следующим образом: 15 с при 95 ° Cи 1 мин при 60 ° С в течение HAdV, JCPyV и BPyV, и 15 с при 95 ° C, 20-е годы при температуре 55 ° С и 20-е годы при температуре 60 ° С в течение ПБНС.
    6. Как только реакция завершена, хранить данные и результаты, как описано в руководстве пользователя используемого оборудования. Количество ДНК будет определяться как среднее из данных, полученных после исправления коэффициент разбавления, когда это необходимо.
  2. Управления
    1. Использование положительного и отрицательного контроля. Анализ должен включать более одного не-шаблон контролем (NTC), чтобы доказать смесь не вызывает флуоресценцию. Желательно, чтобы запустить процесс положительного контроля с целью оценки потенциальных ингибирования ферментов в связи с ингибиторами настоящее время в исследованных образцах.
    2. Запись результатов анализов КПЦР двух различных разведений стандартной ДНК и от процесса управления. Использование результатов, подготовить контрольные карты для контроля качества (КК), программы, связанные с чувствительностью и эффективность анализа.
  3. ПодтверждениеРезультаты
    1. Положительные результаты могут быть дополнительно подтверждена с помощью вложенных ПЦР и нуклеотидной последовательности ампликонов, производя дополнительных данных о нуклеотидных последовательностей штаммов обнаружен 1,5,6,7,9,12.

После процедуры, описанной, человека и животных вирусов были обнаружены и количественно вод для купания, морской и речной воды 2,3. Как типичный пример, молотый проб воды из областей с высокой степенью уровень нитратов были оценены для определения источников загрязнения. Десять-литровые пробы воды были собраны из 4-х различных скважин в сельских районах Северо-Восточного региона в Испании. Пять повторяет были собраны в каждую лунку являясь одним повторить посеяны с человеческим аденовирусом 2 используется в качестве управления процессами. Образцы были обработаны в соответствии с протоколом представлена ​​на рисунке 1. Четыре повторяет проанализированы в одном из четырех участков изучали показал положительные результаты для ПБНС (среднее значение 7,74x10 2 GC / л), который был бы связан с наличием шламов свиней в районах, прилегающих отбора проб и будет поддерживать загрязнения фекалиями свиней в качестве источника нитратов в подземных водах (табл. 2).

4. Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Процедура обнаружения и количественного определения вирусов в воде.

Таблица 1
Таблица 1. Концентрация праймеры и зонды для КПЦР анализов.

Таблица 3
Таблица 2. Обнаружение и количественное определение животных и человека, аденовирусы и polyomaviruses в пробах грунтовых вод.
N количество дубликатов проанализированы
% Процент положительных повторяет
(-) Не обнаружены

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Процедура, описанная выполнит условия для установки методом для рутинной окружающей среды и лаборатории общественного здравоохранения: воспроизводимый, надежный, простой и экономически эффективной. Протокол прост, однако он должен быть тщательно следили. Низкая проводимость в образцах без добавления просил концентрации искусственной морской воде солей бы резко сократить восстановления вирусов как было бы в случае, если помешивая время для флокуляции значительно снижается (менее 5 часов, например).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Две заявки на патенты были поданы в 2009 году для защиты интеллектуальной собственности протоколов для количественной оценки ПБНС и BPyV.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана правительством Испании "Ministerio де Educación у Ciencia» (проект AGL2008-05275-C01/ALI), Европейским Союзом Рамочной исследовательской 7 проектов, финансируемых VIROBATHE (контракт № 513648), VIROCLIME (контракт № 243923 ) и Агентством каталонского Воды, Agencia Catalana де l'Aigua (ACA), Департамент управления де я Millora ДЕЛЬЗ Ecosistemes водных видов спорта. Во время исследования разработан Мартой Rusiñol был членом правительства каталонской "AGAUR" (FI-DGR).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
Высокая скорость центрифуги (8000 мкг) Berckman Coulter Avanti J-20XP
рН-метр, термометр и conductimeter Afora LPPC3003
Пластиковые трубы длиной 100-200 см Deltalab 350059
Стерильные окончил одноразовые пипетки Labclinics PN10E1
Стерильные пластиковые трубы в 1,5 и 10-15 мл (Эппендорф, Соколов и др.) Afora KA298/00
Центрифуга горшки (500 мл) Fisher Scientific SE5753512
Магнитные мешалки и магниты (по одному наобразца) Fisher Scientific 10510
Стеклянные или пластиковые контейнеры с плоским дном, чтобы разрешить использование магнитной мешалки Deltalab 191642
Перистальтического насоса для удаления надосадочной (или водоструйный вакуумный насос) Watson-Marlow 323E / D
Таймер на отключение шевелясь после 8-10 часов Deltalab 900400
Соляная кислота (1н и 0,1) Panreac 141020.1611
Гидроксид натрия (1N) Panreac 131687.1211
Искусственные морской соли морской воды Сигма S9883
Обезжиренное молоко (SM) Difco 232100
Фосфатный буфер рН = 7, 5 1:02 об. / стерильных Na 2 HPO 4 0,2 М и NaH 2 PO 4 0,2 М при рН 7,5
Тиосульфата Panreac 121879.1209 Сделать 10% раствор в воде
QIAamp Вирусная РНК Mini Kit Qiagen 52904
96-и оптические пластины реакции (500 единиц) Applied Biosystems 43426659
Оптический клей охватывает (100 единиц) Applied Biosystems 4311971
TaqMan Экологическая ПЦР Master Mix 2x Applied Biosystems 4396838

Ссылки

  1. Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
  2. Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  3. Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  4. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
  5. Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
  6. Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
  7. Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
  8. Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
  9. de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
  10. Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
  11. Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
  12. Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Концентрирование вирусафлокуляция обезжиренным молокомколичественная ПЦРдетектирование аденовирусаколичественное определение полиомавирусаанализ проб водыэкстракция нуклеиновых кислотмаркеры фекального загрязнениявысокопроизводительный метод
Экономически эффективный метод для отслеживания источника микробного Использование Конкретные человека и животных вирусов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.