Мозаика Анализ функции генов в постнатальном развитии мозга мыши с помощью вирусов основан Cre Рекомбинация

Краткое содержание

В естественных условиях Метод для тестирования функции генов в послеродовом мозга описывается. Рекомбинантный AAVs выражения Cre и / или флуоресцентного белка вводят в мозг новорожденных мышей. Мозаика инактивации гена и редкие нейронов маркировки будут достигнуты, позволяя быстрый анализ функции генов в процессах решающее значение для развития нервной цепи.

Аннотация

Нормальное функционирование мозга зависит не только от эмбрионального развития, когда основные нейронные пути установлены, но также и от послеродового развития, когда нейронные цепи выдерживаются и изысканной. Misregulation на данном этапе может привести к неврологических и психиатрических расстройств, таких, как аутизм и шизофрения ^1,2. Многие гены были изучены в пренатальный мозг и обнаружил, решающее значение для многих процессов развития ^3-5. Тем не менее, их функции в послеродовом мозга в значительной степени неизвестны, отчасти потому, что их удаление у мышей часто приводит к летальности в течение неонатального развития, а отчасти потому, что их требования в раннем развитии препятствует послеродовой анализа. Чтобы преодолеть эти препятствия, floxed аллелей этих генов в настоящее время генерируется у мышей ^6. В сочетании с трансгенными аллелей, которые выражают Cre рекомбиназы в специфические типы клеток, условное исключение может быть достигнуто для изучения функции генов в послеродовом мозга. Однако этот метод требует дополнительных аллелей и дополнительное время (3-6 месяцев) для создания мышей с соответствующими генотипов, тем самым ограничивая расширение генетического анализа больших масштабах в мозге мыши.

Здесь мы показываем, дополнительный подход, использующий вирусно-выразил Cre для изучения этих аллелей floxed быстро и систематически в постнатальном развитии мозга. Вводя рекомбинантный адено-ассоциированные вирусы (rAAVs) ^7,8 кодирования Cre в неонатального мозга, мы можем удалить интересующего гена в различных регионах мозга. Контролируя вирусного титра и coexpressing флуоресцентного маркера белка, мы можем одновременно достичь мозаики инактивации гена и редкие нейронов маркировки. Этот метод позволяет обойти требование многих генов в раннем развитии, а также позволяет изучать их клеточной автономной функции во многих важных процессов в постнатальном развитии мозга, в том числе аксонального и дендритные рост, ветвление и плитки, а также формирование синапса и утонченности. Этот метод успешно применяется в нашей лаборатории (неопубликованные результаты), а другие ^8,9, и может быть распространен и на другие вирусы, такие как лентивирус ^9, а также выражение shRNA или доминирующим активных белков ^10. Кроме того, объединив эту технику с электрофизиологии, а также недавно разработанные оптические инструменты визуализации ^11, этот метод обеспечивает новую стратегию чтобы изучить, как генетические пути влияния развития нервной цепи и функции у мышей и крыс.

Протокол

1. Подготовка вирусов для инъекций

1. rAAVs были приобретены у коммерческих поставщиков рекомендуется, но они также могут быть произведены в собственной лаборатории (см. ниже). Вирус решение, как правило, производится на титр ~ 1x10 ¹² геном копий на миллилитр (GC / мл) и может быть использован на полную титр манипулировать большим числом клеток. Кроме того, они могут быть разбавлены для получения желаемого уровня редкими маркировки. Соответствующего разбавления должен определяться пользователем, но 1:10 разбавления рекомендуется начинать.
2. Оттепель вирусов на лед непосредственно перед употреблением. Передача желаемого предварительного разведения объема вируса раствора в небольшой (~ 250 мкл) ПЦР-пробирку. Развести вируса решения с использованием соответствующего объема стерильной DPBS в капюшоне культуры ткани. Магазин разбавленного раствора вирус на льду, пока это необходимо.

ПРИМЕЧАНИЕ: обработка всех вирусов должно проводиться в соответствии с Протоколом по биобезопасности утвержденным вашей организации

2. Шприц загрузки и монтажа оборудования

1. Подключите загрузки иглы стеклянный шприц и составить вирус решение от ПЦР-пробирку, осторожно потянув поршень. Потяните поршень, пока очень маленький пузырек воздуха можно увидеть в шприц, это означает, что все решения в шприц и не остается в загрузке иглы. Кроме того, небольшое количество инертного красителя может быть добавлен к решению сделать его видимым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: маленькая трубка ПЦР должно использоваться в качестве загрузки иглы, как правило, не достаточно долго, чтобы достичь дна большинства других труб.
2. Удалить загрузку иглу и шприц место на шприц блок шприцевой насос, закрепив его с фиксатора шприца.
3. Аккуратно вставьте один конец соединительной трубки в шприц, вставьте другой конец в иглодержатель. Вставьте инъекции иглу в иглодержатель. Конце инъекции иглу следует обращаться непосредственно в конце соединительной внутри трубок иглодержателя.
4. Медленно нажмите поршень вручную толкать раствора через соединительные трубки. Нажмите до крошечных каплю раствора видна на кончике инъекционной иглой.
5. Осторожно установите поршень рядом с толкателем блок и закрепите его на месте с помощью кронштейна блока толкателя.
6. Установите параметры впрыска: раствор для инъекций скорость должна быть примерно 8μl/min (~ 130nl / с); объемом впрыска, как правило, 1-2UL, выбрать подходящего диаметра шприц для размера шприца вы используете (см. руководство шприцевой насос для руководства).
7. Установите плиту до ~ 38 ° C и накройте бумажным полотенцем или другой тонкий барьер для защиты щенков во время фазы восстановления.

3. Процедура инъекции и щенок восстановления

1. Подготовка P0 или P1 щенков мыши для инъекций, подвергая их к холоду анестезии следующие IACUC утвержденным протоколом. Смочите несколько бумажных полотенец с водой и поставьте на лед. Поместите необходимое количество щенков (4-5) на бумажном полотенце (чтобы они хорошо разделены) и аккуратно складывать бумажные полотенца за щенками, чтобы они покрыты влажным бумажным полотенцем. Аккуратно нанесите небольшое количество дробленого льда на вершине бумажные полотенца и инкубировать щенков в течение примерно 5 минут. Щенков можно держать на льду в течение до 15 минут штрафа и восстановить после этого.
2. После щенка достаточно анестезии, поместите его на монтажный блок (мы используем блок пенополистирола, которая обычно занимает 15 мл пробирки) и установите его для лучшего доступа к инъекции. Для коры легче всего заложить животных плашмя на ее живот, а для мозжечка полезно положение щенка голову над краем блока для обеспечения лучшего доступа к задней части черепа. Щенок может быть обеспечена в месте с пластырем, если это необходимо.
3. Держите щенка голова на месте одной рукой, а игла вставлена ​​вручную через череп в нужное место с другой стороны. Это полезно потянуть кожу жесткой, чтобы предотвратить его перемещение во время инъекции. Для коры полезно делать инъекции по сравнению с четко определенными анатомическими памятники, такие, как лямбда шва черепа, так как это поможет в будущем инъекций. Мозжечке можно увидеть через череп, как тонкая полоска ткани лежащие непосредственно каудально бугорок. Глубина, на которую игла должна быть вставлена ​​немного варьируется между отдельными животными и деформаций и можно судить по заданной маркеров на игле, однако для мозга и мозжечка, мы находим, что глубина ~ 0,5 - 1 мм от поверхности, как правило, подходят. Глубина вставки на другие сайты должны быть определены экспериментально конечного пользователя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: игла должна легко проникать череп, а если этого не произойдет, Не нажимайте слишком сильно, поскольку это может травмировать животное. Перемещение иглы и осторожно попробуйте еще раз.
4. Inject вирус решение. Инъекция началаред, нажав кнопку Пуск на насосе или удручающей педалью, в зависимости от модели давление инжектора используется. В случае отсутствия педали рекомендуется есть коллега помочь с нажатием на кнопку, чтобы минимизировать ненужные движения рук, которые могут повлиять инъекции.
5. После выбранного тома были введены, держать иголку в месте в течение нескольких секунд, а затем аккуратно удалить иглу, сдвинув ее плавно. Будьте уверены, чтобы держать щенка голова на месте, чтобы минимизировать посторонние движения. После инъекций очищается и стерилизуется между экспериментами с этанолом и рана небольшая, применение антисептиков не нужно.
6. Место щенка на крытой плитка с заданной температуры при ~ 38 ° C, чтобы согреть для восстановления, как правило, 5-10 минут. За это время вы можете продолжать инъекционных других щенков.
7. После того как все щенки выздоровели (они должны быть розовыми и перемещение) принять часть дома постельное белье и аккуратно руб щенков с ним. Вернуться щенков к матери в качестве группы.

Примечание: Очень важно, чтобы убедиться, что щенки теплые и подвергаются дома постельных принадлежностей до возвращения их к матери и вернуть их в качестве группы. Невыполнение этого требования может привести к матери ранения или убийства детенышей.

4. Очистка оборудования

1. После инъекции, является полной и щенки были возвращены их матери, чистая инъекции установки за счет полной загрузки шприц с ацетоном или 70% этанола. Флеш решения путем инъекций установки в несколько раз, используя свежий раствор каждый раз. Это позволит удалить все оставшиеся решение вирусов и осадков. Ацетона или этанола будет испаряться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетон является предпочтительным для очистки, но, если установка использует любой ацетон-чувствительные компоненты, такие как цианоакрилат клея, а затем использовать 70% этилового спирта для этих шагов.
2. Лечить рабочая зона с отходами отбеливателя и выбросить в соответствующий контейнер для биологически опасных.

5. Анализ

1. Жертвы животных в нужном возраста, использующих IACUC утвержденным эвтаназии метод. Перфузии фиксации рекомендуется, чтобы помочь в дальнейшей визуализации инфицированных нейронов, особенно у взрослых животных.
2. Стандартные процедуры иммуноокрашивания могут быть использованы для усиления флуоресцентный сигнал. Короче говоря, 100 мкм плавающей vibratome разделы проницаемыми с PBS +1% Тритон Х-100 и блокируются в PBS +1% Тритон Х-100 +10% нормальной козьей сывороткой. Разделы инкубируют в блокировании решения с первичными антителами в течение ночи при 4 ° С с последующим дополнительным мойки и блокировки. Разделы затем инкубировали в блокировании решения с вторичными антителами в течение 2 часов при комнатной температуре, тщательно промывают, установленный на слайды и coverslipped с анти-Fade монтажа средств массовой информации. Cryosections может также использоваться для визуализации меченых нейронов, однако эндогенной флуоресценции может быть потеряна.

6. Представитель Результаты:

Успешного прохождения процедуры инъекции будет производить надежные инфекции нейронов в области инъекции без заметных повреждений тканей или другие виды жестокого воздействия на животных. Как показано на рисунке 1, распространению инфекции может наблюдаться в Cre-репортер мышей (ROSA26R) ¹² вводили rAAV8-Cre в различных анатомических участках. Инъекции в конкретных регионах, таких как кора и верхний бугорок, обычно генерируют местные инфекции с минимальным распространением на соседние регионы (рис. 1А-Б). Использование решения высокой титра вируса делает инфекции смежных областях, таких как гиппокамп, что более вероятно (рис. 1А). Инъекции с низким титром вируса решение приводит к редкой инфекцией, которая обычно остается вблизи места инъекции, как показано на мозжечка инъекции rAAV8-Cre в средней линии ROSA26R репортер мышей (рис. 1С-D). Мы наблюдали рекомбинации у мышей ROSA26R репортером в течение 2 дней после введения rAAV8-Cre, предполагая, что инфекция, рекомбинации и экспрессии генов репортер все это может происходить относительно быстро. Кроме того, мы успешно использовали этот метод для изучения влияния генов на удаление не-РОСА локус использованием floxed условного аллель, результаты которого будут опубликованы в другом месте.

Число клеток, инфицированных должно коррелировать с титром вводят вирусные решение. Например, потребители инъекционных смесь высококачественных решений титр двух rAAV8 вирусов, выражающих различные флуоресцентные белки в мозжечке заражает множество клеток Пуркинье, которые дифференциально помечены (рис. 2). Наоборот, потребители инъекционных низкой решение титра вируса может привести к редкой инфекцией, чтобы помочь в визуализации отдельных клеток (рис. 2В). Флуоресцентно меченых нейронов можно наблюдать непосредственно в свежем срезе, живые ткани (рис. 2, б) или могут быть подвергнуты иммунной повышения эндогенного флуоресцентные сигналы для последующего получения изображения на широком поле или сотрудничествоnfocal флуоресцентной микроскопии (рис. 2, рис. 3A-C). Наконец, rAAV8 способен инфицировать различных типов нейронов в коре головного мозга с сильными маркировке тонких процессов (рис. 3А-C).

Рисунок 1: LacZ окрашивания в мозгу ROSA26R репортер мышей, которые были введены с rAAV8-Cre при Р0 демонстрирует Cre деятельности и места инфекции.

1. Широкое поле зрения сагиттальной P14 мозга показывает высокий титр (1x10 ¹² GC / мл), инъекции в коре головного мозга и верхний бугорок. Использование высоких титра вируса делает его более вероятно, что прилегающих территорий также будут инфицированы.
2. Сагиттальный разделе P14 коры вводится с более низким титром (1x10 ¹¹ GC / мл) вирус демонстрирует местной инфекции с меньшим распространением.
3. Wholemount зрения P28 мозжечка вводят в средней линии с низким титром (1x10 ⁹ GC / мл) вирус решение показывает, что инфекция редко и обычно остается вблизи места инъекции.
4. Сагиттальный зрения средней линии мозжечка в C). Обратите внимание, что как правило, только клетки Пуркинье заражены rAAV8.

Рисунок 2: мозжечка маркировки в виде инъекций с высокими и низкими титрами rAAV8 выражения флуоресцентных белков.

1. Сагиттальной разделе P21cerebellum инфицированных смесь двух вирусов выражения EGFP (зеленый) и DsRed (красный). Высокая смесь титр вируса был использован для заражения большого количества клеток Пуркинье.
2. Клетками Пуркинье в мозжечке жить P14 от очень низкого титра вирусной инфекции отображаемого сразу после вскрытия.

Рисунок 3: Корковая маркировки на rAAV8-DsRed.
Примеры различных типов корковых нейронов в корональных участков коры P21, который был заражен rAAV8-DsRed точке Р0.

Обсуждение

Новорожденных вирусный метод инъекции, представленные здесь обеспечивает простой и быстрый способ создания в естественных условиях мозаика для изучения постнатального развития мозга. Метод использует floxed аллели, которые в настоящее время, а также те, которые делаются в рамках Группы высокого Гена Пропускная Ориентация проекта ^6. По сравнению с использованием трансгенных выражение Cre, этот метод обеспечивает быстрый способ проверить функции генов в различные типы клеток, как мышей, несущих floxed ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
rAAV8-Cre,-GFP,-DsRed,	Векторные Биолабс	# 7060, # 7061, пользовательский порядок	http://www.vectorbiolabs.com
Гарвардский насоса 11 Plus	Гарвардский аппарата	# 702208	(Нет ногой педаль порт)
Пигментного эпителия сетчатки инъекций Kit	Инструменты Всемирного Precision	РПЭ-KIT	Содержит соединительной трубки, введение иглы (36G) и иглодержателя
NanoFil шприц, 100 мкл	Инструменты Всемирного Precision	NANOFIL-100	Включает в себя многоразовые иглы загрузки
D-PBS	Invitrogen	14040-117
GFP антител	Aves	GFP-1020
DsRed антител	Clontech	632496
Отопление Блок	VWR	97042-610
ROSA26R мыши	Лаборатории Джексона	003309