Целевая подготовка Ультразвуковые Вокализации в возрасте и Паркинсона Крысы

Краткое содержание

Голос расстройств изнурительных в процессе старения и болезни Паркинсона. Ультразвуковые вокализации крыс, также зависит от этих условий, могут быть использованы для изучения этих расстройств голоса, их нейронных субстратов, а также характер восстановления функций с поведенческими вмешательства.

Аннотация

Нарушения голоса являются распространенным осложнением как болезни Паркинсона (БП), так и старения; они могут значительно снизить качество жизни, влияя на коммуникативные способности. ^{1, 2} Целевые тренировки (логопедическая и голосовая терапия) позволяют скорректировать определенные дефициты голоса,^{3, 4} хотя лежащие в их основе механизмы поведенческого вмешательства изучены недостаточно. Систематическое исследование нарушений голоса и терапии должно учитывать множество факторов, которые трудно контролировать у людей, таких как возраст, домашняя среда, время, прошедшее с начала заболевания, тяжесть болезни и принимаемые лекарственные препараты. Метод, представленный здесь, использует животную модель вокализации, которая позволяет систематически изучать, как базовые сенсомоторные механизмы изменяются в результате целевых голосовых тренировок. Процедуры ультразвуковой записи и анализа, описанные в данном протоколе, применимы к любому исследованию ультразвуковой вокализации грызунов.

Ультразвуковая вокализация грызунов становится ценной моделью для исследования нейронных субстратов поведения.^5-8 Вокализации как у грызунов, так и у людей обладают семиотической значимостью и создаются путем модификации выдыхаемого потока воздуха с помощью гортанного сужения.^{9, 10} Таким образом, вокализации грызунов могут служить полезной моделью для изучения дефицита голоса в сенсомоторном контексте. Кроме того, модели на крысах позволяют изучать нейробиологические основы восстановления после дефицита функций с помощью направленного обучения.

Для моделирования БП мы используем крыс линии Long-Evans (Charles River Laboratories International, Inc.) и индуцируем паркинсонизм путем одностороннего введения 7 μg 6-гидроксидофамина (6-OHDA) в медиальный пучок переднего мозга, что вызывает умеренную или выраженную дегенерацию пресинаптических нейронов стриатума (подробности см. в Ciucci, 2010).^{11, 12} В качестве модели старения мы используем крыс гибрида Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).

Нашим основным методом стимуляции вокализации является помещение половозрелых самцов крыс в контакт с полово восприимчивыми самками. Когда самец проявляет интерес к самке, ее удаляют, после чего самец продолжает вокализацию. Путем поощрения сложных вокализаций пищей или водой можно увеличить как количество сложных вокализаций, так и частоту вокализации (Рисунок 1).

Ультразвуковой микрофон, установленный над домашней клеткой самца, регистрирует вокализации. Запись начинается после того, как самку крысы убирают, чтобы изолировать призывы самца. Вокализации можно просматривать в режиме реального времени для обучения или записывать и анализировать в автономном режиме. Путем записи и акустического анализа вокализаций до и после вокального обучения можно оценить влияние заболевания и восстановление нормальной функции в результате тренировок. Данная модель также позволяет соотнести наблюдаемые поведенческие (вокальные) улучшения с изменениями в головном мозге и нервно-мышечной системе.

Протокол

1. Pre / Post-обучение Recordings

1. Начните ультразвукового контроля с использованием Avisoft Recorder конфигурации, показанной на рисунке 2.
2. Ультразвуковые вокализации может контролироваться либо визуально, наблюдая в реальном масштабе времени спектрограмма, или на слух с наушниками подключен к интерфейсу записи ультразвука.
3. Место сексуально восприимчивы (в течке) женщин крысы в ​​клетке дома субъекта самцов крыс. Признаки течки включают лордоза, ухо шевелить и быстрое дартс. Женщины в течке вызывают более вокализации от мужчин, чем не сексуально восприимчивы женщины.
4. После мужчина проявляет интерес в женском (например, нюхают, чеканка, и / или монтажа), удалите женский рекорд вокализации и мужчины в течение 1-2 минут.
5. Если самец не озвучить сразу, кратко возвращения женщины крысы на главную клетке самца, чтобы стимулировать вокализации.

2. Вокальное обучение

1. Начните ультразвукового контроля с Avisoft записи по той же схеме показано на рисунке 2.
2. Место самцов крыс в своем доме клетке под микрофон.
3. Положите крысу женщины в доме клетку самца. Как указывалось ранее, женщина крысы должны быть в течке максимально вокализации ответа от мужчины.
4. Как только мужчина проявляет интерес в женском удалить женщины.
5. Сразу же после самец производит целевой вокализации, вознаграждение одновременно с нажмите пером и краткая презентация бутылку воды или пищи удовольствие. Изначально, любой 50-кГц модулированного (рис. 5B) вызов вознаграждены. Как обучение прогрессирует только все более сложных строк звонков, таких как строки от 5 до 10 звонков в быстрой последовательности, усилены.
6. Продолжить тренировку пока не дали 30 подкреплений. Это обычно занимает от 5 - 10 минут.

3. Подготовка к акустического анализа

1. Всегда архив оригинальных звуковых файлов и внесения изменений и измерений на рабочей копии, а анализ потребует фильтрации и удаления шума от каждого файла.
2. Использование пакетный режим Avisoft SASLab Pro, фильтра верхних частот все звуковые файлы, которые будут проанализированы при 25 кГц для удаления нежелательных шумов ниже ультразвуковые вокализации.
3. Для того чтобы использовать функцию автоматического обнаружения SASLab Pro, шумовой порог сначала должен быть определен. Чтобы сделать это, откройте звуковой файл и создать спектрограммы, используя настройки показаны на рисунке 3.
4. Автоматические измерения параметров Дисплей должен быть настроен в соответствии с настройками, показанными на рисунке 4.
5. Найти области спектрограммы, где Есть нет звонков или шумы, это фоновый шум.
6. Использование "автоматический (один порог)" вариант, установить порог в разделе Элемент разделения Автоматическое измерений параметров диалогового окна установки, чтобы чуть выше фонового шума, регулируя черная линия в окне спектра мощности выше спектрограммы. На рисунке 4, порог был установлен на -55 дБ.
7. В нижней части диалогового окна, установить "Отклонить, если пиковая амплитуда меньше, чем" значение на 1 дБ ниже порога найти в предыдущем шаге. Эти два значения должны теперь быть использован для всех звуковых файлов проанализированы, предполагая, что все настройки записи были одинаковыми.

4. Вокализ Идентификация

1. Чтобы пометить вокализации с помощью автоматического порог, установленный выше, сначала создать спектрограммы с вышеуказанными параметрами.
2. Вручную стереть любой шум, который отвечает следующим критериям: 1) был ошибочно идентифицирован как вокализация, 2), влияющих дискриминации в начале и / или в конце вокализация, и / или 3) был ошибочно идентифицирован как высокий или низкие частоты в вокализации (указаны верхний и нижний красные линии, соответственно). Кроме того, старт / стоп времена вокализации этикетки можно регулировать вручную после создания постоянной метки в шаге 4.5 ниже. Шум, влияющих высокие и низкие частоты измерений, однако, должны быть вручную удалены.
3. В некоторых случаях вокализации не смогут быть отделены от окружающих шумов, таких как звук постельные принадлежности во время передвижения. В этих случаях, вызов не может быть точно проанализированы и должны быть удалены.
4. После того как все вокализации были определены, постоянно стирать удаленные разделы спектрограммы от звуковой файл, выбрав пункт "Удалить стерты спектрограммы разделы сигнал ..." из инструментов выпадающего меню. Если эта команда не выполняется до спектрограммы закрыт, все стирания работа будет потеряна.
5. Создание постоянных меток в звуковой файл, нажав кнопку "изменить" кнопку в разделе Элемент Разделение автоматической окно настройки параметров измерений.
6. Визуально и на слух рассмотреть каждый помечены вокализации для определения его категории: простые, частота модуляции (FM), или гармоники. ЗадницаIGN соответствующие этикетки с использованием предопределенных текстовых модулей. Примеры каждого вокализации категории представлены на рисунке 5.
7. Закрыть спектрограммы, сохранить звуковой файл, и переходите к следующему звуковой файл для анализа.

5. Акустические измерения

1. После вокализации во всех звуковых файлов было выявлено, используйте инструмент пакетной обработки (Сервис: Batch Processing) для автоматического измерения акустических параметров всех файлов.
2. В диалоговом окне пакетной обработки, выберите "Автоматические измерения параметров" из выпадающего меню.
3. Выберите "обработать все файлы в выбранной папке" флажок затем нажмите кнопку "папки" и выберите папку, в которой звуковые файлы будут сохранены.
4. Нажмите кнопку "Пуск", а каждый файл будет автоматически анализируется в соответствии с настройками в последний раз использовал в окне Автоматическое измерение параметров диалога настройки.
5. Измерения будут сохранены в текстовый файл, который можно определить с помощью DDE Параметры / Log File Настройка команду. Этот текстовый файл может быть импортирован в программу для статистического анализа.

6. Представитель Результаты:

Ультразвуковые вокализации крыс страдают от физиологических изменений, связанных со старением и 6-OHDA моделях болезни Паркинсона ¹³ Как правило, мы видим, снижения качества ультразвуковые вокализации характеризуется сокращением следующие количественные параметры акустических. Пропускную способность, пик частоты, продолжительности , и по интенсивности. На рисунке 6 показана частотно-модулированных вокализации крыс в модели БП на трех различных временных точках: базовая линия, после индукции ПД, и после вокализации обучения. В условиях PD, вызов показывает сокращение пропускной способности, продолжительности и интенсивности. Кроме того, частотная модуляция стала нерегулярной.

В дополнение к деградации конкретных акустических параметров, мы также наблюдаем меньше общей сложности типов вокализации производится в возрасте и паркинсонизм крыс. Например, после индукции PD крысы производит большее количество простых вызовов и меньше частоты модулированных вызовов. После обучения вокализации, многие акустические параметры, такие как продолжительность и интенсивность, уровень базового подхода и ряд сложных вызовов увеличивается (рис. 6). Старых крыс проявляются аналогичные деградации акустические параметры в их ультразвуковые вокализации. Мы в настоящее время изучает последствия вокальной подготовки в возрасте крыс.

Рисунок 1. Количество вокализации за сессию (цель встретила всех крыс в неделю) и вокализация ставка (среднее значение и стандартную ошибку показано) и увеличение по сравнению с 6-недельного периода обучения в группе, как молодых (9 месяцев) и старых (32 мо) Фишер 344/Brown Норвегии F1 крыс.

Рисунок 2 представителя вокализации каждой из трех категорий 50 вокализации кГц;. () Простые, (B) частотной модуляцией, а (С) гармоники.

Рисунок 3. Представителю частотно-модулированного вокализации из одной крысы на () базового уровня, (б) пост-PD индукции, и (С) после вокализации обучения.

Обсуждение

Ультразвуковые вокализации у крыс кажутся уязвимыми к старению и болезням процессов, таких как болезнь Паркинсона. Эти ультразвуковые вокализации обеспечить поведенческой модели вокальные функции, включая дефициты, которые сопровождают физиологические изменения, связанные с болезнями и старением. Кроме того, акустические изменения в ультразвуковых вокализации легко измеряется и количественно. Кроме того, ультразвуковые вокализации может быть изменен с помощью поведенческого вмешательства. Таким образом, крысы ультразвуковые вокализации обеспечивают полезную модель для изучения воздействия болезней, старения и терапевтическое вмешательство на обоих поведение и лежащий в основе нейробиологических механизмов.

Наш метод вокальной подготовки использует условный раздражитель (нажмите), связанные с положительное подкрепление (вознаграждение воды или пищи лечения). Затем нажмите награду используется для усиления вокализации возрастающей сложности. Мы определяем комплекса вокализации, как те, которые содержат "трель" (частота модулированного) компонента (рис. 5B) по сравнению с теми, которые являются "плоскими" и поддерживать одну частоту (рис. 5А). Эта частота модулированного компонент легко идентифицируется по синусоидальной внешний вид. Хотя 50-кГц вокализации могут быть полностью синусоидальной (рис. 5B), обычно сталкиваются с более сложной 50-кГц вокализации, которые состоят частично из этой частоте модулированного компонента, а также либо больших скачков по частоте или краткие плоской составляющей. Эти более сложные вокализации, возможно, короткими перерывами менее 10 мс между компонентами, но считается одной вокализации. Хотя более подробную суб-классификация этих вокализации можно в автономном режиме, ¹⁴ найдены все 50-кГц вокализации содержащие частотно-модулированных компонент комплекса снизить потребность в онлайн субъективные классификации и снизить усиление изменчивости. В своей тестовой среде важно выбрать, как данные классифицированы и проанализированы в соответствии дизайн исследования, который подходит для целей исследования.

Есть много факторов, которые следует учитывать при использовании этого протокола. Прежде всего, несмотря на генетическую однородность и процедурную последовательность, крысы имеют переменную ответ на обучение. Некоторые крысы естественно вокализ больше, чем другие, ⁵ или мотивированы воздействия женщин более чем на награду пищи и воды. Один из способов учета этого изменчивость, исследуя изменения акустических параметров от вокализации отдельных крыс базовым для их пост-поражения и после обучения вокализации. Хотя это и не обсуждается в данном протоколе, у нас есть поведенческие тесты количественно интерес женщин, таких как задержка расти. Кроме того, в зависимости от возраста и уровня активности отдельных крыса, проволока верхней могут быть необходимы на главной клетке во время тренировок, чтобы предотвратить побег. Несмотря на индивидуальной изменчивости, мы успешно использовали этот протокол на различных штаммов и возрастов для улучшения вокализации по сравнению с исходным каждой отдельной крысы.

Крысы очень чувствительны к казалось бы, небольшие изменения в окружающей среде, такие как запахи, температура, и персонал. Усилия должны быть направлены, чтобы избежать душистых продуктов личной гигиены, такие как лосьоны, волос и парфюмерии. Перед тем как обучение, человек должен быть удобным, взаимодействующих с и обработки крыс. Кроме того, любые несоответствия в персонал и окружающую среду может повлиять на ответ вокализации крыс.

Потому что крысы ведут ночной образ жизни, они должны находиться на обратном цикле свет, чтобы обеспечить обучение пройдет в темное часть своего цикла, когда они наиболее активны. Мы освещать наш тренажерный зал с красными огнями. Кроме того, если вода награду используется в процессе обучения, крысы должны иметь ограниченный доступ к воде. Наши крысы воды ограничены в течение 21 часов до тренировки. Три часа воздействия воды определялось по нашей институциональной уходу и использованию животных комитета должны быть наименее ограничительными период времени, что позволило воды, чтобы быть полезным в качестве подкрепления в наши поведенческие исследования, не представляющие существенного компромисса для здоровья животных и благополучия. Крысы получают доступ к воде в случайные моменты времени (10 минут до 30 минут) после тренировки, а затем иметь свободный доступ к воде в течение трех часов в темное время часть их света цикла. Крысы должны проверяться каждый день на наличие признаков обезвоживания и весил через день, чтобы у пассажиров было никакого существенного (более 10%), потеря веса. Питание ограничение не является необходимым при использовании пищи рассматривать в качестве награды. Лечит специфичные для крыс имеются в продаже, но мы нашли небольшой кусочек сладких хлопьев, чтобы быть эффективным награду.

Как упоминалось выше, у самок крыс в течке вызывают выше вокализации ответ от мужчин, чем не сексуально восприимчивы женщины. Поддерживая большое число женщин в колонии, есть высокая вероятность, что намере одна женщина будет в течке в любой день. Тем не менее, течки может быть также фармакологически индуцированных у самок крыс при подкожном инъекционных 10 мкг β-эстрадиола в 0,1 мл стерильного кунжутное масло за 48 часов до тренировки затем 500 мкг прогестерона в 0,1 мл стерильного кунжутное масло за 4 часа до тренировки. Кроме того, крыс-самцов, которые наивно самок крыс должна быть сексуальный опыт до вокальной подготовки. Это достигается путем размещения самка крысы, которые проявляет признаки полового восприимчивость (дартс, лордоз, ухо шевелить) в доме клетку самца, пока мужчина монтирует и эякуляции. Мужчины не удается подключить в течение первых нескольких сессий и женщины могут быть удалены после того, интерес мужчины шоу в самку нюхают и / или в погоне за женщинами вокруг клетки. Половым испытывают производится один раз в день в течение двух недель. Этот период также дает возможность для крыс, чтобы приучить к экспериментатору (ов) и записи комнате.

Одним из ограничений этого метода является субъективное определение вокализации типа. Кроме того, этот фактор ограничивает скорость сбора данных, так как каждый вызов должен быть независимо рассмотрены и классифицированы вручную. С этим связана важность наличия опытных оценщиков, которые были последовательно обучение в вокализации идентификации. И внутри и меж-оценщик надежность должна быть оценена в пределах вашей собственной лаборатории.

Таким образом, ультразвуковые вокализации у грызунов используются во многих различных моделей для изучения мозга поведении отношения, в том числе эмоциональные состояния, награды и наркомании, и болезненных состояний, таких, как аутизм. ^6,14-16 Этот новый метод является способом изучения механизмы, лежащие целевых вокальной подготовки для лечения голос дефицита в старении и болезни Паркинсона. Этот метод имеет потенциал, чтобы быть применены в других моделях болезни, которая влияет на общение и голос.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Имя	Компания	Номер в каталоге
Конденсатор ультразвуковой микрофон CM16/CMPA	Avisoft биоакустики	40011
UltraSoundGate 116Hb	Avisoft биоакустики	41161
Avisoft-рекордером	Avisoft биоакустики	10201
Avisoft-SASLab Pro	Avisoft биоакустики	10101