Подготовка взрослых Drosophila Глаза для тонких Секционирование и микроскопический анализ

Краткое содержание

Стандартный подход к подготовке взрослых Drosophila Глаза для полу-тонкие и легкие срезов микроскопического анализа представлена ​​здесь. Протокол может быть использован для валового морфологического анализа глазом дефектов, или с указанной поправки могут быть использованы для определения генетических требования генов в специфических типов клеток в глазу (например, клонального анализа фоторецепторов) или электронно-микроскопического анализа.

Аннотация

Drosophila давно используется в качестве модельной системы для изучения развития, главным образом благодаря легкости генетических манипуляций. За прошедшие годы было создано множество мутантных линий и технических приемов, позволяющих ставить сложные вопросы и получать ответы на них за разумное время. В ходе прямого и обратного генетического анализа Drosophila были получены фундаментальные сведения о взаимодействии компонентов всех известных основных сигнальных путей. Глаз мухи оказался исключительно подходящим объектом для мутационного анализа, поскольку в лабораторных условиях мухи могут выживать без функциональных глаз. Кроме того, поверхность глаза насекомого состоит примерно из 800 отдельных единичных глаз (фасеток или омматидиев), которые при рассмотрении под диссекционном микроскопе образуют правильную гладкую поверхность. Таким образом, легко определить, влияет ли мутация на развитие или рост глаза, оценивая внешне потерю гладкости поверхности (фенотип «грубого глаза»; Рис. 1) или общий размер глаза соответственно (примеры скринингов, основанных на внешней морфологии глаза, см., например, ¹). Последующий детальный анализ фенотипов глаза требует фиксации, заливки в пластик и изготовления тонких срезов глаз взрослых особей.

Глаз Drosophila развивается из так называемого имагинального диска глаза — скопления эпителиальных клеток, которые пролиферируют и дифференцируются на личиночной и куколечной стадиях (для обзора см., например, ²). Каждый омматидий состоит из 20 клеток, включая восемь фоторецепторов (PR или R-клетки; рис. 2), четыре секретирующих линзу конусные клетки, пигментные клетки («гексагон» вокруг кластера R-клеток) и щетинку. Фоторецепторы каждого омматидия, которые легче всего идентифицировать по их светочувствительным органеллам — рабдомерам, организованы в виде трапеции, состоящей из шести «внешних» (R1-6) и двух «внутренних» фоторецепторов (R7/8; R8 [рис. 2] находится под R7 и поэтому виден только на срезах из глубоких областей глаза). Трапеция каждой фасетки точно выровнена относительно соседних фасеток, а также общих антеропостериорной и дорсовентральной осей глаза (рис. 3A). В частности, омматидии дорсальной и вентральной (черная и красная стрелки соответственно) половин глаза являются зеркальными отражениями друг друга и соответствуют двум хиральным формам, устанавливаемым в ходе сигнализации планарной полярности клеток (для обзора см., например, ³).

Описанный здесь метод получения полутонких срезов глаза (таких как представленные на рис. 3) является слегка модифицированным вариантом метода, первоначально описанного Tomlinson и Ready⁴. Он позволяет проводить морфологический анализ всех клеток, за исключением прозрачных конусных клеток. Кроме того, пигмент R-клеток (синие стрелки на рис. 2 и 3) может быть использован в качестве клеточно-автономного маркера генотипа R-клетки, что позволяет легко определить генетические требования к генам в определенной подгруппе R-клеток^5,6.

Протокол

1. Fly голову рассечение

1. Убедитесь, что все материалы под рукой (в том числе покрытые желатином слайды). Подготовка глутаральдегида и осмия фиксаторов (см. ниже). Пер генотип для встраивания, аликвоту 200 мкл решение исправить глутаральдегида в 1,5 мл труб на льду.
2. Обезболить летает на CO ₂ площадки (обычно мы проанализируем семь лететь головы вставлять шести в генотипе в случае, одна голова разрушен во время процедуры).
3. Удержание и слегка нажмите грудной клетки летать, спинной стороной вверх, с помощью пинцета и использование острого скальпеля, чтобы отрезать голову.
4. Стабилизировать летать голову, касаясь шеи с пинцетом и аккуратно отрезать небольшую часть одного глаза. Это улучшает проникновение фиксатором (если вы собираетесь использовать разделы око за клонального анализа, вырезать глаз с отсутствием или меньше клоны). Старайтесь не прикасаться и повреждения нетронутыми глаза, который позже будет секционного.
5. Сенсорный головы с помощью пинцета или скальпеля на поверхности отрезать глаз и передачу головой в глутаральдегида / фосфат фиксатором на льду (руководители часто плавают на верхней части фиксатора) расчлененный головы не должны храниться в глутаральдегида исправить дольше чем за 15 минут до того осмия. Повторите шаги с 1.2-1.5 с других мух одного и того же генотипа.

2. Фиксация и вложение (используйте перчатки для всех шагов!)

1. Спиновые flyheads в центрифуге Эппендорф течение 1 минуты при 10000 оборотах в минуту. Продолжить, даже если главы не тонут.
2. Добавить 200 мкл OsO ₄ решения и исправить, по крайней мере 30 минут до 1 часа на льду.
3. С помощью пипетки Пастера, удалить глутаральдегида / осмий решение (не забудьте использовать надлежащие процедуры утилизации отходов!) И заменить 200 мкл решение осмия. Инкубировать на льду в течение 1-6 часов. Всегда проверяйте главы полностью покрыты жидкостью и никогда не удалить все решения в качестве руководителей или в глаза может рухнуть!
4. С помощью пипетки Пастера, отказаться от фиксатора, добавить 0,5-1мл 30% этилового спирта и выдержать в течение не менее 5 минут на льду (не забудьте использовать надлежащие процедуры утилизации отходов с этанолом в настоящее время содержит Осмий!).
5. Повторите предыдущий шаг с 50%, 70%, (80%), 90% и в два раза 100% этанола. Включая 80% этанола шаг, если использование глаз для электронно-микроскопического анализа. После 70% мыть шаг, образцы могут быть удалены из льда.
6. Замените этанола с равным объемом окиси пропилена (летучие, продолжают работать в капюшоне). Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
7. Повторите мыть окиси пропилена. Работа в партии, если обработка многих генотипов параллельно, чтобы избежать коллапса в глаза из-за испарения окиси пропилена.
8. Удалите большую часть окиси пропилена и использование пластиковой пипетки передачи, добавить около 500 мкл в 1:01 смолы: раствор оксида пропилена. Равновесие на ночь при комнатной температуре.

3. Вложения и расположение в формах

1. Убедитесь, что все формы помечены, чтобы следить за своими различных генотипов, а затем заполнить формы с 100% смолы. Не перегружайте (нет "высокие горы" по поверхности формы при взгляде прямо по поверхности формы). Используйте жесткие смолы для анализа EM.
2. Использование передачи пипетки удалить 50% смолы от головы, заменить 100% смолы, и выдержать в течение 3-4 часов при комнатной температуре. Как головки проникли со смолой, они опускаются на дно пробирки.
3. Используя зубочистку, которая была хитом на твердую поверхность, один раз, чтобы создать маленький крючок, передача одной голове в то время в форму.
4. Место алюминиевой фольги на рабочую область вашего рассекает рамки для защиты от смолы разливов.
5. Использование рассекает иглу и, глядя если ваш объем, вихрем голову слегка в смолу и осторожно переместите ее на дно формы близки к заостренным концом.
6. Тщательно выровняйте поверхность без изменений (!) Глаза (или вашего будущего секционирования плоскости, если вы хотите иметь сечения) горлышком вниз с передней стенки формы, убедившись, что держать тангенциальной поверхности глаза примерно половина головы диаметром от формы стены. В редких случаях, глаз падает, которые могут рассматриваться как пустое пространство между поверхностью глаза и голова кутикулы. Если у вас есть рухнула глаз, заменить его на ^7-й запасной глаз.
7. Повторить со всеми руководителями. После этого со всеми выравнивания, еще раз проверьте все глаза, чтобы убедиться, что они не двигались, когда вы удалили иглу из смолы.
8. Если у вас возникли проблемы с глазами движущихся при удалении рассекает иглы, положение глаз, как желаемое, быстро убрать иглу немного в сторону от головы, а затем медленно извлеките иглу полностью.
9. Выпекать формы в течение ночи при 70 ° C.

4. Обрезка и секционирования

1. Удалить закаленной кварталах от формы, сгибая формы, кeeping отслеживать, какой блок соответствует генотип которых (например, хранить в небольших флаконах сцинтилляционных).
2. Для отделки используется патрон подходит для вашей микротома, который установлен лицевой стороной вверх на блок из оргстекла или алюминия. Горы блок для отсечения, глаз, в патроне.
3. В области с помощью вскрытия с тефлоновым покрытием бритвы велел, тщательно отрезать только верхний слой вашего блока. Это оставит прозрачную поверхность, через которые вы должны увидеть глаза и тем самым могут предсказывать будущее плоскости срезов. Избегайте резки ваши пальцы!
4. Отрезанные остатки пластмассы по обе стороны головы и на передней (т.е. то, что когда-то в верхней части формы при выравнивании глаз), пока большая часть пластиковых всему голова отрезана. Лучше всего медленно приближаются голову отрезать несколько тонких слоев пластика.
5. Используя чистую лезвие бритвы, осторожно удалите тонкие слои из верхней части глаза в точной плоскости вы хотите разделу (как правило, по касательной к глазу, под небольшим углом к ​​исходной поверхности плесени).
6. Продолжайте, пока вы не начнете срезать внешнюю поверхность глаза. Убедитесь, что вы используете чистых районах лезвие, чтобы получить блестящие, прозрачные поверхности, что делает выравнивание в микротома легче.
7. Чтобы сэкономить на бритвенные лезвия, используют старые лезвия для сырой обрезки по бокам блока и использовать свежим лезвием для тонкой отделки (первое сокращение и 4.6). В конце концов у вас будет три пирамиды с небольшим наклоном, отключение топ, который соответствует вашей будущей плоскости сечения.
8. Горы блока в микротоме. Фактические секционирования будет варьироваться в зависимости от типа микротома и не будут подробно описаны здесь. Мы используем Sorvall MT5000 с бриллиантом историка качества нож, чтобы сократить 0,5 до 1 мкм разделов. Для легких микроскопический анализ, небольшие изменения в разделе толщиной не имеют значения. Если секционирования клонов отмечен Белый + трансгенов, раздел 1 мкм разделов, чтобы обеспечить достаточно гранулы пигмента, прилегающих к рабдомерами в каждой секции (рис. 2).
9. Разделы будет плавать на воде. Поднимите первых 20-30 секций с уплощенной конце деревянной Q-Tip из-под поверхности воды в вращательное движение и передача их в каплю воды на желатин покрытием предметное стекло (хранится на нагревательного элемента составляет около 100 ° C ).
10. Повторите с другой 20-30 разделов. Подождите, пока вода не испарится и секций придерживаться слайда. Как правило, разделы 3 глаза расположены в три колонки (три глаза) по строкам местечко (сверху / снизу разделов), хорошо ложатся на один слайд.

5. Окрашивание и микроскопический анализ

1. Если секционирования клонов, пятно разделов. Место слайд с разделами на нагревательный блок установлен на уровне 90 ° C. Внесите толуидин-голубого окрашивания раствор из 30 мл шприца придает 0.22μm фильтр на слайд и пятно на 10 секунд. Немедленно промыть широко дистиллированной водой. Воздух сухой.
2. Использование пластиковой пипетки передавать, распространять по 3 капли DPX монтажа среды на слайд и накройте покровным стеклом. Вершина с 3 пятаков и пусть монтажа среду затвердевают (например, на ночь при комнатной температуре).
3. Изображение с светового микроскопа. Использование 5x или 10x объектив, чтобы найти хороший раздел, а затем переключиться на 63x объектив иммерсионного масла для детального анализа и фотографирования. Мы обычно используем настройки фазового контраста, темного поля, но оптика работать.

6. Представитель результаты:

Чаще всего, глазами, внедренных в пластик для детального анализа внешней грубой фенотипы глаз определяется как часть генетического экране или в процессе тестирования генетических взаимодействий с генами, как известно, влияют либо общей структуры глаза или полярности. Типичные результаты глаз разделах приведены на рисунке 3. Дикого типа омматидиев (рис. 3) показывают полный фоторецепторов окруженных решетки пигментные клетки. Напротив, в косоглазие (stbm, больше известный как Ван-Гог ⁷⁾ мутанта, омматидия полярности теряется, и, несмотря на полный фоторецепторов присутствует, вращения и хиральности рандомизированы (рис. 3В). Кроме того, поскольку stbm аллель секционного был в AW ^- фон, пигментные гранулы отсутствуют на рис. 3B. Рис 3C показывает пример клонального анализа. Дрозофилы Rho киназы (drok) требуется для омматидия вращения, а также для структурной целостности глаз ^8. Гомозиготные drok ² клоны могут быть определены из-за отсутствия пигмента в пигментных клетках и рабдомерами (как правило, клоны индуцированные использованием безглазые-ФЛП и P-элемента с сильно выраженным белым маркерный ген дополняет фоне ш ^- мутация в дикой природе типа и гетерозиготных ткани). Таким образом, можно выявить мутантный областях их отсутствие пигмента. В связи с клеточной автономии пигментации в R-сеООО упоминалось ранее, генотипов отдельных R-клеток может быть определена (см. стрелки на рис. 3C).

Рисунок 1. Глазу дрозофилы является отличной моделью системы для биологов, поскольку, в отличие от гладкой поверхности дикого типа глаз (), поверхность глаза мутанта внешне часто грубой (B), что указывает на основной фенотипом глаз . Во всех фигур, передняя находится слева и спинной вверх. Изображения любезно предоставлены д-р Дженнифер Curtiss, NMSU, Лас-Крусес, NM, США.

Рисунок 2. Свет микроскопических изображений одного омматидии секционного помощью описанного метода. Только семь R-клетки видны в то время, в омматидия, так как R7 лежит на верхней части R8. (А, А ') На R7 уровне тела клетки R7 обнаруживается между R1 и R6 (желтые стрелки). В противоположность этому, на уровне R8 (Б), тела клетки R8 обнаружен между R1 и R2 (желтая стрелка в В '). Синие стрелки знак пигментные гранулы, которые могут быть использованы в качестве клеточной автономных пигмента маркером.

Рисунок 3. Тангенциальный разделах через дикого типа (А), stbm (Б) и drok (C) мутант взрослые глаза дрозофилы. Схемы ниже разделов указывают полярность омматидиев (см. (А) для стрел). Круги представляют омматидиев с дефектами в фоторецепторных дополнение. Желтая линия спины / вентральной линии симметрии (экватора). В отличие от хорошо ориентированную омматидии дикого типа (А), плоская организация теряется в stbm мутанта (Б). Обратите внимание, что раздел stbm мутанта показано не хватает пигмента из-за его ш ^- мутант фоне. (C) Потому что drok мутации имеют летальные последствия, они должны быть проанализированы в клонов. Таким образом, пигментные клетки дикого типа или гетерозиготной (заполняется синей стрелки), а R-клеток не хватает пигмента (открытое синее наконечники стрел) гомозиготных мутантов. В дополнение к вращению дефектов, drok мутантов также показывают, структурные дефекты в том числе отсутствие или избыточное количество R-клеток. Заметим, что для клонального анализа, разделы не окрашивали, чтобы избежать затемнения пигментные гранулы.

Обсуждение

Использование дрозофилы как модельного организма, генетические экранов привело к идентификации многие из членов-основателей семейств генов необходимо для большей части хорошо сохранились и сигнальных путей у высших эукариот, включая человека. Так, в лабораторных условиях, функциональное глаз необязательной для выживания, глаз особенно хорошо подходят ткани для открытия новых функциях генов и оценки генетических сетей. Ультраструктурные анализ летать глаза, используя описанный метод таким образом привели к фундаментальным открытиям, имеющих значение для развития и болезней. Первоначально одной клетки клонального анализ проводили с использованием рентгеновской индуцированных клонов в сочетании с известными тесно связаны клеточной автономных рецессивных маркеров. В последнее время наличие ФЛП / FRT система для создания клонов значительно облегчило фенотипического анализа летальных мутаций в глаза разделов ^6,9.

Анализ глаз разделов не ограничивается тангенциальной разделах описано здесь. При желании, головки могут быть выровнены в любом положении в пресс-форм и поперечные срезы могут быть получены в исследовании более глубоких слоев в голову такие как пластинка и мозгового вещества. Протокол, описанный здесь, таким образом, универсальный метод для анализа глаз и головы структур взрослых дрозофилы.

Материалы

Общее оснащение:

• Для животноводства летать общем см. ¹⁰
• Стандартный микроскопом вскрытия (например, Nikon СМЗ-645 стерео Увеличить микроскоп), желательно с источником световое кольцо, чтобы предотвратить бросает тень из ваших рук.
• CO ₂ Fly площадку, покрытую 3MM ватмане, чтобы обеспечить защиту от грязи во время вскрытия.
• Желатин покрытием слайдов: растворить 10 г желатина и 1 г CrKSO ₄ х 12 H ₂ O в 1 л воды на плитке (приносят почти до кипения, занимает около 2 часов). Dip хорошо промывают (мыла) и промыть (дН ₂ O), слайды в держателях в раствор желатина и воздушно-сухой покрытой фольгой на ночь.
• Отопление печей (70 ° С; старые печи вакуумные, которые были использованы для сушки нитроцеллюлоза фильтр хорошо подходят для этой цели).
• Микротом способны ультратонких срезов (0.5-1 мкм секции), например те, что используются электронная микроскопия объектов. Мы используем Sorvall MT5000 ультрамикротоме с алмазным ножом качество историка. Стекло ножи также работать.

Фиксация решения:

• Подготовка исходного раствора 0,2 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,2.
• Подготовка 2% глутарового альдегида в 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,2 (можно хранить при температуре 4 ° С в течение 4 недель). Сделайте по крайней мере достаточно, чтобы иметь 200 мкл в генотипе вы хотите встроить. Держите на льду.
• Осмий решения: 2% OsO ₄ в 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,2. Делайте только достаточно иметь 200 мкл в генотипе вы хотите внедрить, так как решение не может быть сохранен. Держите на льду.

Глутаральдегид и OsO ₄ обладают высокой токсичностью и должны быть обработаны с особой осторожностью в хорошо вентилируемом капот. Использовать фильтр советы при работе с OsO _4, чтобы предотвратить почернение вашей пипетки.

Обезвоживание: Сделайте 30%, 50%, 70% (80%), 90% и 100%-ного раствора этанола. Предпочтительно прохладно 30%, 50%, 70% этанола на лед перед использованием.

Окрашивание решение:

1% Толуидин-голубых в 1%-Бура.

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
	Мягкий	Жесткий
Смола	54g	50г
Отвердитель B	44.5g	50г
Ускоритель C	2,5 г	1.75g
Пластификатор D	10g	0.75g

Таблица 1. Смола подготовки

Для подготовки смолы, осторожно, но тщательно перемешать все ингредиенты в пластмассовых стаканчиков с использованием магнитной мешалки с большим мешалкой. Избегайте пузырей. После смешивания аликвоту в стандартных флаконах сцинтилляционный или аналогичных емкостей и заморозить при -20 ° C. Используйте мягкие смолы для всех приложений, если ваш объект EM просит труднее формулировке. Используйте перчатки для обработки смол (канцерогенный в Неполимеризованные форме). Для полимеризации смол на оборудование и отходы, выпекать при температуре 70 ° С в течение ночи. Отходы могут быть затем безопасно выброшен и оборудование очищены и повторно использованы. Пролитая Неполимеризованные смолы могут быть очищены с изопропанола.

Реагент	Поставщик	Номер в каталоге
Fly площадку	например Джинеси	59-119
Глутаральдегид	Сигма	G7526-10 X 10 ML
OsO 4	Polysciences, Inc	0972A-20
Propyleneoxide	Рыболов	04332-1
Скальпель ручки, для # 3	Рыболов	22080046
Скальпель лезвия # 11	Рыболов	08-916-5B
Передача пипетки	Рыболов	13-711-7М
Durcupan (R) ACM смолы	Sigma (Fluka)	44610-1EA
Сталь рассекает иглы	Рыболов	S17346
Беем плоской формы вложения	Электронная микроскопия Sci.	70904-12
С тефлоновым покрытием лезвий	Электронная микроскопия Sci.	71970
Q-Tip (стерильные тампоны)	Рыболов	14-959-81
Стекло слайдов	Рыболов	12-550-143
Покровные стекла № 1, 22X60 мм	Рыболов	12-531K
Желатин	Рыболов	ICN96010280
Cr (III) К SO 4 dodecahydrate	Сигма	243361
Алмазный нож историка, 6мм	Diatome США	Его 60-
Толуидиновым синим O	Рыболов	BP107-10
Бура (тетраборат Na-)	Рыболов	AC20629-1000
DPX монтажа среда	Сигма	44 581-100мл

Таблица 2. Материалы