Белки мембранные наложения Пробирной: протокол для тестирования Взаимодействие растворимых и нерастворимых белков В пробирке</em

Краткое содержание

Тестирование белок-белковые взаимодействия является необходимым условием для вскрытия белка функциональности. Здесь мы вводим В пробирке Белок-белковых связывания для исследования мембранного белка с иммобилизованным растворимого белка. Этот препарат обеспечивает надежный метод для проверки взаимодействия между нерастворимых белков и белков в растворе.

Аннотация

Проверка взаимодействий между различными белками жизненно важна для исследования их биологических функций на молекулярном уровне. Существует несколько методов, как in vitro, так и in vivo, для оценки связывания с белками, и для получения достоверных выводов следует провести как минимум два метода, которые дополняют недостатки друг друга.

Для анализа in vivo анализ бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) представляет собой наиболее популярный и наименее инвазивный подход, который позволяет обнаружить белок-белковое взаимодействие в живых клетках, а также определить внутриклеточную локализацию взаимодействующих белков ^1,2. В этом анализе нефлуоресцентные N- и C-концевые половины GFP или его вариантов сливаются с исследуемыми белками, и когда два гибридных белка объединяются в результате взаимодействия испытуемых белков, флуоресцентный сигнал восстанавливается^3-6. Поскольку его сигнал легко обнаруживается с помощью эпифлуоресценции или конфокальной микроскопии, BiFC стал мощным инструментом выбора среди клеточных биологов для изучения белок-белковых взаимодействий в ^{живых клетках}. Однако этот анализ иногда может давать ложноположительные результаты. Например, флуоресцентный сигнал может быть восстановлен двумя фрагментами GFP, расположенными на расстоянии до 7 нм друг от друга из-за плотной упаковки в небольшом субклеточном компартменте, а не из-за специфических взаимодействий.

Из-за этих ограничений результаты, полученные с помощью технологий визуализации живых клеток, должны быть подтверждены независимым подходом, основанным на другом принципе обнаружения белковых взаимодействий. Анализы ко-иммунопреципитации (Co-IP) или глутатионтрансферазы (GST) представляют собой такие альтернативные методы, которые обычно используются для анализа белок-белковых взаимодействий in vitro. Однако в этих анализах испытуемые белки должны быть легко растворимыми в буфере, который поддерживает реакцию связывания. Таким образом, конкретные взаимодействия с участием нерастворимого белка не могут быть оценены с помощью этих методов.

Здесь мы иллюстрируем протокол анализа связывания белковой мембраны, который позволяет обойти эту трудность. В этом методе взаимодействие между растворимыми и нерастворимыми белками может быть надежно проверено, поскольку один из белков иммобилизован на мембранной матрице. Этот метод в сочетании с экспериментами in vivo, такими как BiFC, обеспечивает надежный подход к исследованию и точной характеристике взаимодействий между растворимыми и нерастворимыми белками. В данной статье с помощью этой методики демонстрируется связывание между белком движения (МП) вируса табачной мозаики (TMV), который выполняет множество функций во время вирусного межклеточного транспорта^8-14, и недавно идентифицированным растительным клеточным взаимодействием, белком, содержащим анкирин табака (ANK) ¹⁵.

Протокол

1. Выражение и извлечения белков

1. Дифференциально теги белки должны быть проверены на их обнаружение. Этикетка белка для иммобилизованных на мембране (ProIM) с тегом больших размеров (например, стоимость), а неконденсированное тег может быть использован в качестве иммобилизованных отрицательного контроля (ProIMnc). Этикетка белков для использования в качестве растворимых зонд (ProSol) либо с большим или небольшим тегов. Предохранитель же тег в соответствующий негативный контроль растворимого белка (ProSOLnc) и включить в анализ взаимодействия для подтверждения специфичности обнаружены обязательными.
2. Выбор системы экспрессии белка, чтобы выразить меткой белки, то есть, Е. палочка, бакуловирус и т.д., в зависимости от требований потенциальных сообщение поступательные изменения и урожайность белков.
3. Извлечение ProIM и ProIM _пс из организма выбора (шаг 1,2) с помощью SDS-PAGE загрузки буфера (20% глицерина, 4% SDS, 20 мМ Трис-HCl, pH6.8), содержащий протеиназы коктейль ингибитора. Оставьте клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 15 мин, добавить 0,5% 2-меркаптоэтанола и кипятите в течение 5 мин.
4. Извлечение ProSol и ProSol _пс из организма выбора (шаг 1,2), используя стандартные протоколы ^16. Эти белки должны быть хорошо растворимы в связывающем буфере (140 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT, 1% БСА, 0,1% Твин-20), используемых в шаге 4.1.
5. Определить концентрацию рекомбинантных белков с использованием стандартного метода, например, Bio-Rad комплект анализа белка. такие как Bio-Rad комплект анализа белка. Если сырой экстракт, а не очищенный белок, используется для анализа, оценки концентрации белка интерес в этом экстракте методом сканирующей денситометрии соответствующей зоны на SDS-полиакриламидном геле окрашивали Кумасси Brilliant Blue R-250 и с помощью известных концентрации БСА в качестве справочных.

2. Иммобилизация ProIM и ProIMnc на мембране

1. Resolve два набора экстрактов, каждый из которых содержит 1 мкг ProIM и ProIM _пс на SDS-полиакриламидном геле в соответствии со стандартным протоколом ^16.
2. После электрофореза, место передачи геля в 100 мл буфера передачи (60 мМ глицина, 10 мМ Трис, 0,0006% SDS, 20% метанола) и инкубировать при легком помешивании в течение 20 мин при комнатной температуре.
3. Электропереноса белки, содержащиеся в геле для нитроцеллюлозы мембраны в соответствии со стандартным протоколом ^16.

3. Re-складывания мембраной белков

1. После электропереноса, инкубировать мембраны в течение 15 минут в 15 мл буфера (30 мМ Трис-HCl pH7.4, 0,05% Твин-20) с нежным агитацию, чтобы удалить остатки SDS.
2. После слива тщательно, передача мембраны до 25 мл буфера денатурации (7 М гуанидина гидрохлорида, 2 мМ EDTA, 50 мМ DTT, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3). и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре при легком помешивании. (Примечание: нитроцеллюлозные мембраны становится непрозрачной, когда инкубировали в денатурации буфера). и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре при легком помешивании.
3. Передача мембраны до 25 мл TBS (10 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,4) и инкубировать при легком помешивании в течение 5 мин (Примечание: На этом этапе, мембрана восстанавливает свою первоначальную белого цвета).
4. Передача мембраны до 25 мл буфера для связывания (см. шаг 1.2) и инкубируют при 4 ° С с нежным агитацией за одну ночь.

4. Зондирование ProIM по ProSol

1. Вырезать мембраны на две полосы, каждая из которых содержит ProIM и ProIM _пс.
2. Сделать ProSol и ProSOLnc решения гибридизации путем разведения препарата с 1-10 мкг либо ProSol или ProSOLnc в 10 мл свежего буфера для связывания. Передача каждого мембрану в ProSol или ProSOLnc гибридизации раствора и инкубировать в течение 1,5 ч при комнатной температуре при легком помешивании.
3. Удалить мембраны от гибридизации решений и промыть три раза в течение 15 минут в каждом из TBS.

5. Визуализация белок-белковых взаимодействий с помощью метода иммуноблоттинга

1. Блок мембраны с 2,5% обезжиренного молока в TBST (10 мМ Трис-HCl, 140 мМ NaCl, 0,05% Твин-20, рН 7,4) в течение 1 часа при комнатной температуре. Развести первичного антитела (анти-strepII поликлональных антител кролика) в 0,5% обезжиренного молока в TBST при концентрации, рекомендованные производителем.
2. Место заблокированный мембраны в раствор антител и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С при легком помешивании.
3. Промыть мембраны в 20 мл TBST в течение 15 минут, и дважды в течение 5 мин при комнатной температуре с нежным агитации.
4. Развести вторичные антитела (анти-IgG антитела кролика), сопряженных с пероксидазой хрена (HRP) в 0,5% обезжиренного молока в TBST при концентрации, рекомендованные производителем. Место мембран в вторичными антителамиРешение и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре с нежным агитации.
5. Промыть мембраны в 20 мл TBST в течение 15 минут, и дважды в течение 5 мин при комнатной температуре с нежным агитации. После окончательного полоскания в TBS, визуализировать белок-белковые взаимодействия с использованием субстрата ПХ хемилюминесценции (например, Millipore Immobilon западной хемилюминесцентный HRP подложки).
6. Зонд же мембран с первичными антителами для тега, слитый с ProIM, после чего соответствующие вторичные антитела, как описано в шагах 5,1 до 5,4. Визуализируйте ProIM и ProIMnc как описано в шаге от 5,5 до проверки личности полосы, полученные в наложения мембранного белка анализа (шаг 5.5). В большинстве случаев, зачистки не нужно, потому что сигнал получен этот шаг гораздо сильнее, чем остаточная сигнала, полученного на шаге 5.5.

6. Представитель Результаты:

АНК-MP взаимодействия наблюдался BiFC в табачных клеток эпидермиса (рис. 1А). Потому что депутат высоко нерастворимый белок, выраженных в бактерии или в растениях, наложения мембранного белка анализа было принято для проверки этого взаимодействия в пробирке (рис. 1В). Белки экстракты, содержащие 1 мкг GST-MP (ProIM) или неконденсированное GST (ProIM _пс) решались путем SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, а затем электропереноса на нитроцеллюлозные мембраны. Когда эти ProIMs были исследованы с растворимыми АНК-strepII (ProSol), GST-MP, но не неконденсированное GST, выставлены обязательными (рис. 1Б, дорожки 1, 2, по сравнению с полосы 5, 6). Более того, когда же набор ProIMs были исследованы с несвязанными ProSOLnc, т.е. Arabidopsis цитоплазматической киназы NADH меткой strepII (NADH3-strepII), нет привязки не наблюдалось, дальнейшие демонстрации специфики АНК-MP взаимодействия (рис. 1Б, дорожки 3, 4).

Рисунок 1. Специфическое связывание табака АНК к ВТМ МП в естественных условиях и в пробирке. () АНК-MP взаимодействия в живых табака клеток эпидермиса, обнаруженных BiFC. Сильный сигнал YFP был реконструирован, когда депутат и АНК, слитый с С-концевым и N-терминал половинки YFP, соответственно, были coexpressed в табачных эпидермиса следующие microbombardment их гены, кодирующие. Это BiFC сигнал, накопленный в puncta на периферии клетки, которые являются диагностика плазмодесмами ^15. (B), АНК-MP взаимодействия в пробирке, обнаруженных белков анализ наложения оболочки. Белки экстракты, содержащие 1 мкг GST-MP (ProIM) или неконденсированное GST (ProIMnc) были решены на 15% SDS-полиакриламидном геле с последующей электропереноса на нитроцеллюлозные мембраны. GST-MPProIM и GSTProIMnc инкубировали с 0,5 мкг / мл АНК-strepII (ProSol) и АНК обязательным был обнаружен с помощью зондирования мембраны с анти-strepII кролик поликлональных антител, а затем анти-IgG кролика + М вторичными антителами конъюгированных с HRP (дорожки 1 и 2). Ни GST-MPProIM ни GSTProIMnc взаимодействовали с несвязанными белка, Arabidopsis цитоплазматической киназы NADH, слитый с strepII тегом (ProSOLnc, полосы 3 и 4). Идентичность группы наблюдалось в данном исследовании было подтверждено с помощью зондирования мембраны с анти-GST антител (полосы 5 и 6). Когда мембраны обрабатывали денатурации буфера без промывают буфером, связывание GST-депутата АНК потеряно, в то время как неизвестные белки, содержащиеся в GST-МП и GST contining экстракты белка взаимодействует с АНК-strepII, что свидетельствует о важности от 3,1 до шаг процесса денатурации (дорожки 7 и 8).

Обсуждение

Этот подход подходит для тестирования белок-белковых взаимодействий между комбинациями белков, когда по крайней мере один из которых белки хорошо растворим в связывающем буфере, и была успешно применена к другим сочетанием белков ^17,18. IInteractions между белками, которые являются нерастворимыми в этих условиях не может быть проверено этим протоколом.

Кроме того, успешное рефолдинг ProIM имеет решающее значение для анализа. Промывка мембран в TBS после электропереноса является кл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Комплект белка анализа	Bio-Rad	500-0001
Ингибитора протеиназ коктейль	SIGMA	S8820
Мини-система Protean	Bio-Rad	165-8000
Полусухой западных промокательной SD электропереноса системы	Bio-Rad	170-3940
Анти-IgG кролика антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена	GenScript	A00098
Анти-GST кролик поликлональных антител	GenScript	A00097
Анти-strepII	GenScript	A00626
BioTrace, NT нитроцеллюлозы передачи мембраны	Pall Научные	27377-000
Immobilon западной хемилюминесцентный HRP субстрат	Millipore	WBKL S0 050