$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Создание модели мыши, похожей на PCOS
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, использованные в этом исследовании, были смешанного происхождения (C57/B6, CD1, 129Sv) и содержались с пищей и водой в неограниченном количестве в 14/10-часовом цикле свет/темнота при 24 °C.
- Приготовление пеллет DHT
- Автоклавная силастическая трубка для стерилизации. Отрежьте силастические трубки длиной 15 мм лезвием бритвы.
- Запечатайте одну сторону, введя в трубку медицинский клей и силикон с помощью тупой иглы массой 20 г, прикрепленной к шприцу объемом 3 мл. Поршень следует извлечь из шприца, а затем ввести клей в резервуар. Поршень снова вставляют, и клей нажимают вниз до тех пор, пока он не начнет выходить из иглы. Затупленная игла изготавливается путем разрезания острой стороны кончика иглы 20 G любыми прочными ножницами. Длина силикона в тубе должна быть более 2 мм, чтобы можно было обрезать после производства.
- Высушите в течение ночи; проверьте наличие пузырьков воздуха на герметичной стороне. Те, в которых нет пузырьков воздуха, используются для гранул DHT. Другие могут быть использованы для контроля пеллет без ДГТ.
- Наденьте перчатки, маску, очки и лабораторный халат перед изготовлением ДГТ-гранул в капюшоне, чтобы избежать контакта ДГТ с кожей.
- Насыпьте порошок DHT в пластиковую лодку для взвешивания и вдавите открытую сторону пробирок с клейкой крышкой (произведенных в 1.1.1) в порошок DHT.
- Порошок DHT можно утрамбовать с помощью большой скрепки, которая распрямляется. Продолжайте до тех пор, пока ДГТ не достигнет высоты 4 мм (или желаемой длины). Проверьте длину DHT с помощью линейки, и запечатайте открытую сторону силиконом, высушите на ночь.
- Отрежьте каждую запечатанную сторону, чтобы длина силикона составила 2 мм. Общая длина пеллеты составит 8 мм.
- Загерметизируйте обе стороны пустой силастической трубки в качестве контрольной (без ДГТ) гранулы.
- Храните гранулы в конической тубе объемом 50 мл, обернутой фольгой (для предотвращения воздействия света) при комнатной температуре до использования. Пеллеты DHT сохраняют полную эффективность в течение как минимум 3 месяцев хранения.
- Установка и замена ДГТ
- До 20 гранул ДГТ или контрольных гранул погружают отдельно в коническую пробирку объемом 50 мл с 30 мл стерильного 0,9% физиологического раствора на 24 ч при 37 °C для уравновешивания непосредственно перед введением.
- Перед операцией поверхности и перчатки дезинфицируются с помощью клидокса, а рабочие поверхности накрываются чистой абсорбирующей бумагой с пластиковой подкладкой (хирургической прокладкой). Все инструменты, контактирующие с животными, обеззараживаются перед входом в помещение для животных путем автоклавирования. Перед использованием инструменты должны высохнуть и остыть.
- Используются 2-месячные самки мышей (4–5 мышей в клетке). Мышам внутрибрюшинно вводят ксилазин (3,5 мг/кг веса тела) и кетамин (78,8 мг/кг веса тела) с помощью инсулинового шприца. Расчеты для смешивания и дозирования анестезии приведены в таблице 1.
- После достижения адекватной анестезии, измеряемой потерей рефлекса на пальцах ног и замедлением дыхания, мышь будет подготовлена к операции.
- Продезинфицируйте кожу участка бетадином с помощью стерильной марли и очистите 70% этанолом. Область снова будет окрашена бетадином.
- Вырежьте ножницами отверстие длиной около 5 мм под кожей возле шеи. С помощью трохара 10 G сделайте небольшой тоннель (15 мм) в ростральном направлении. Дробинка вводится дорсально вместе с трохаром.
- Затем отверстие запечатывается хирургическим клеем. Вручную приблизьте края раны с помощью щипцов и аккуратными движениями щеткой, чтобы нанести тонкую пленку жидкого клея на приближенные края раны. Нанесите 3 тонких слоя клея, чтобы клей равномерно распределился по ране. Клей должен простираться на 1 см с каждой стороны от присоединенных краев раны. Для закрытия отверстия также можно использовать шовные или хирургические зажимы. Поместите мышей обратно в клетку, в индивидуальном жилье, с грелкой для восстановления. Заменяйте гранулы каждые 4 недели, чтобы поддерживать постоянный уровень воздействия андрогенов. Исходная гранула будет удалена, а новая будет вставлена, как описано выше, в аналогичном положении.
| Кетамин
(100 мг/мл)
| Ксилазин
(100 мг/мл)
| соляной
(0.9%)
|
| 175 μл | 15 μл | 810 μл |
| Внутрибрюшинное введение рабочего раствора: 0,1 мл/20г массы тела |
Таблица 1. Коктейль из кетамина/ксилазина.