Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Индукция SE
- Купите 8-недельных самцов мышей C57BL/6NHsd и взвесьте каждую мышь. Затем с помощью маркера отметьте хвосты всех мышей для их легкой идентификации во время индукции СЭ.
- Рассчитайте количество скополамина метилбромида (скополамин; 2 мг/кг), гемисульфата тербуталина (тербуталина; 2 мг/кг) и пилокарпина гидрохлорида (пилокарпин; 280 мг/кг) в зависимости от веса мыши и добавьте физиологический раствор (0,9% NaCl, 10 мл/кг) для приготовления растворов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если вес мыши составляет 25 г, применяются следующие количества: скополамин и тербуталин: 2 мг/кг * (25 г/1000 г) = 0,05 мг, физиологический раствор: 10 мл/кг * (25 г/1000 г) = 0,25 мл, пилокарпин: 280 мг/кг * (25 г/1000 г) = 7 мг, физиологический раствор: 10 мл/кг * (25 г/1000 г) = 0,25 мл.
- Загрузите смесь скополамина и тербуталина в шприц объемом 1 мл с иглой 30 G. Введите раствор внутрибрюшинно каждой мыши, а затем верните мышей в их клетки. Через 30 минут после введения скополамина и тербуталина ввести раствор пилокарпина каждой мыши (внутримышечно; 1 мл шприца; игла 30 г). Сразу после инъекции пилокарпина поместите мышей в инкубатор (28–30°C) для наблюдения.
- Внимательно следите за поведением мышей до тех пор, пока не будет индуцирована СЭ. Если обнаружены лимбические моторные припадки, соответствующие стадии 3 или выше по шкале Расина, запишите время и понаблюдайте за мышами, чтобы определить, происходят ли припадки чаще. Если непрерывные моторные припадки продолжаются более 2 минут, поместите мышь в новую клетку при комнатной температуре и продолжайте наблюдение в течение 3 часов, чтобы определить, продолжаются ли судорожные припадки и вызвана ли СЭ. Усыпьте мышей, которые не смогли войти в СЭ примерно через 2 ч после инъекции пилокарпина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шкала Расина; стадия 1, движения рта и лица; 2 этап, кивок головой; 3 стадия, клонус передних конечностей; стадия 4, вдыхание на дыбы с клонусом передних конечностей; Стадия 5, вставание на дыбы и падение с клонусом передних конечностей. Если мышь не перевести в клетку при комнатной температуре сразу после индукции СЭ, мышь может погибнуть из-за гипертермии.
- Поведенческие острые судороги прекращают через 3 ч после начала СЭ путем введения раствора диазепама (внутримышечно 10 мг/кг; 1 мл шприца; игла 30 г). Приготовьте раствор диазепама, разбавив 5 мг/мл диазепама в 10% полиоксил-35 гидрогенизированном касторовом масле путем добавления физиологического раствора (внутримышечно 10 мл/кг; 1 мл шприца; 30 г иглы). <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: 10% раствор гидрогенизированного касторового масла полиоксила 35: 1 мл раствора гидрогенизированного касторового масла полиоксила 35 + 9 мл физиологического раствора. Храните раствор при комнатной температуре. Например, если масса тела мыши составляет 25 г, введите 250 мкл раствора диазепама: 50 мкл 5 мг/мл диазепама + 200 мкл 10% полиоксила 35 раствора гидрогенизированного касторового масла = 250 мкл 1 мг/мл диазепама.
- Для фиктивных мышей проведите внутривенное введение смеси скополамина метилбромида и гемисульфата тербуталина (внутримышечно; 2 мг/кг, 10 мл/кг; 1 мл шприца; игла 30 г). Через 30 мин введите физиологический раствор внутрибрюшинно (внутривенно; 10 мл/кг; 1 мл шприца; игла 30 г).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если масса тела мыши составляет 25 г, введите 250 мкл физиологического раствора вместо пилокарпина.
- После инъекции диазепама (внутримышечное введение; 1 мл шприца; игла 30 G) введите 1 мл 5% декстрозы на каждую отдельную мышь (внутримышечно; 1 мл шприца; игла 26 G).
ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мл 5% декстрозы для инъекций обеспечивает источник энергии и гидратацию, что может увеличить выживаемость.
- Во время постухода в инкубаторе (28–30 °C) вытирайте излишние выделения, такие как слюна, слезы и кал
.
- В 1-й день после индукции СЭ взвесьте мышей и оставьте их в инкубаторе (28–30 °C) в течение одного дополнительного дня. На 2-й день, после индукции СЭ, взвесьте мышей и верните их в домашнюю клетку. Обеспечьте их влажным кормом, чтобы облегчить их восстановление.
Примечание: В этом эксперименте смертность от C57BL/6NHsd после прекращения SE составила в среднем 8,57% (3 из 35 протестированных мышей).
- Измеряйте суточную массу тела животных до 7 дней после пилокарпина и вводите мышам 5% декстрозу (внутримышечно; 1 мл шприца; игла 26 г), когда масса тела не увеличилась. Прекратите мониторинг массы тела><, когда мыши начнут набирать массу тела, и без проблем употребляйте влажную пищу через 2 дня после инъекции пилокарпина.
Примечание: Если масса тела мыши не увеличилась в течение 7 дней после ЧС, исключите мышь из эксперимента и усыпьте углекислым газом. В зависимости от происхождения мыши, время от времени может наступать смерть; однако в случае C57BL/6NHsd менее 1% мышей умерли в этих экспериментах. При выживаемости более 7 дней после индукции СЭ мыши редко погибают в латентный период.
