Получение органоидов из опухолей: 3D-модель опухоли in vitro

Описанные здесь процедуры на животных были выполнены с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Департаменте лабораторных ресурсов животных, Комплексный онкологический центр Розуэлл Парк, Буффало, Нью-Йорк.

ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы мышей, которые будут препарированы для выделения простаты или опухолей простаты для генерации органоидов, должны были как минимум достичь возраста половой зрелости — около 8-10 недель. Конкретный возраст мышей может варьироваться в зависимости от исследования. Некоторые факторы, которые следует учитывать при выборе возраста, включают возрастные изменения в популяциях клеток предстательной железы, возрастную экспрессию специфических трансгенов Cre, управляемых промоторами, и скорость прогрессирования опухоли предстательной железы в конкретном GEMM.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показано графическое описание процедуры генерации опухолевых органоидов.

1. Подготовка

1. Приготовьте органоидную среду предстательной железы мыши по Drost et al. со следующими изменениями. Используйте кондиционированную среду вместо рекомбинантных белков для Noggin и R-спондина и используйте конечную концентрацию 1% (v/v) вместо 10% для среды, кондиционированной Noggin- и R-Spondin.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HEK293, стабильно трансфицированные HA-мышиным Noggin-Fc или HA-мышиным Rspo1-Fc, используются для получения среды, кондиционированной Noggin- или R-спондином, соответственно. Эти клеточные линии были подарком от лаборатории Кельвина Куо в Стэнфордском университете.
2. Приготовьте раствор для разложения в пробирке объемом 15 мл, разбавив 20 мг/мл коллагеназы II с помощью среды Advanced DMEM/F12(+++) до конечной концентрации 5 мг/мл. Добавьте Y-27632 Rock Inhibitor в раствор коллагеназы II в конечной концентрации 10 мкМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение буфера для пищеварения к тканевым запасам составляет от 1 мл до 50 мг, которые мы используем в соответствии с Drost et al.

2. Измельчение и переваривание опухолевой ткани

1. В капюшон для клеточных культур поместите ткань опухоли предстательной железы в стерильную чашку для культуры диаметром 10 см, препарируйте и отбросьте некротизированную ткань.
2. Оставшуюся ткань опухоли предстательной железы измельчите в³ кубика размером 1 мм, удерживая кусочки ткани стерильными изогнутыми щипцами и разрезая ножницами для препарирования.
3. Поместите измельченные кусочки опухоли в пробирку объемом 15 мл с буфером для пищеварения, зачерпнув их изогнутой стороной щипцов. Опухолевую ткань переварить при температуре 37 °C с встряхиванием в течение 1,5-2 часов. Проверяйте ход пищеварения каждые 20 мин.<чел/> ПРИМЕЧАНИЕ: В это время выньте не менее 2 мл матрицы из хранилища -20 °C и разморозьте на льду. Для оттаивания 1 мл аликвот матрицы потребуется примерно 3 часа.
4. После разложения тканей центрифужную пробирку при 175 x g в течение 5 минут при 4 °C для образования клеточной гранулы.
5. Извлеките надосадочную жидкость, поверните трубку, чтобы ослабить клеточную гранулу, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл предварительно подогретого трипсина, дополненного 10 μM Y-27632 Rock Inhibitor. Поставьте трубку на водяную баню при температуре 37 °C на 5 минут.
6. После инкубации пипетку вверх и вниз 5 раз с помощью стандартного наконечника P1000. Верните трубку на водяную баню при температуре 37 °C еще на 5 минут и повторите шаг 2.6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В это время процедуры согрейте стерильную 6-луночную чашку для клеточных культур, поместив ее в инкубатор при температуре 55 °C.

3. Подсчет ячеек и ресуспензия в матрице

1. Промойте ячейки, добавив 9 мл холодного AdDMEM/F12(+++) и центрифугируйте пробирку при 175 x g в течение 5 минут при 4 °C.
2. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость, поверните пробирку, чтобы ослабить гранулу, и снова промойте клетки, добавив 10 мл холодного AdDMEM/F12(+++). Центрифугируйте пробирку при давлении 175 x g в течение 5 минут при 4 °C.
3. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость, поверните трубку, чтобы ослабить гранулу, повторно суспендируйте клетки в 1 мл AdDMEM/F12(+++) и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра в соответствии со стандартной процедурой.
4. Семь-восемь куполов помещаются в одну лунку 6-луночной чашки, когда органоиды помещаются в матрицу по каплям. Примерно из 200 мкл матрицы получится 7-8 куполов. Решите, сколько лунок органоидов необходимо для будущих экспериментальных целей, и рассчитайте требуемый объем матрицы. Затем рассчитайте объем раствора, содержащего клетки, который должен иметь конечную концентрацию 1,0 x 10⁶ клеток/мл матрицы.
5. После подсчета клеток центрифугируйте при 175 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость, поверните пробирку, чтобы ослабить гранулу, и снова суспендируйте клетки в объеме матрицы, рассчитанном на шаге 3.4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица остается в жидком виде только при 4 °С; Всегда держите на льду исходные пробирки и растворы с матричными ячейками.

4. Покрытие матричных куполов и применение сред

1. Смешайте раствор матричных ячеек с пипеткой P200, чтобы равномерно распределить клетки без образования пузырьков. Извлеките 6-луночную чашку для культивирования из инкубатора при температуре 55 °C.
2. Осторожно наберите пипеткой 200 мкл раствора матричных ячеек и быстро капните раствор в лунку для создания куполов.
3. Повторяйте шаг 4.2. до тех пор, пока не будет израсходован объем раствора матричной ячейки. Дайте куполам застыть при комнатной температуре в течение 2 минут.
4. Переверните 6-луночную форму вверх дном и поместите чашку в инкубатор с температурой 37 °C для продолжения застывания в течение 20 минут.
5. После инкубации добавьте по 2 мл органоидной среды предстательной железы мыши в каждую лунку. Добавьте синтетический андроген R1881 в каждую лунку до конечной концентрации 1 нМ и ингибитор горных пород Y-27632 до конечной концентрации 10 мкМ. Тщательно перемешайте и поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C для культивирования><. ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидные питательные среды необходимо дополнять 10 μM Y-27632 Rock Inhibitor в течение всего 1 недели после генерации органоидов.

Рисунок 1: Блок-схема протокола генерации органоидов опухоли предстательной железы. После рассечения опухоли простаты измельчите ткань на кусочки по 1 мм. Расщепляют кусочки опухоли в коллагеназе, собирают клетки и расщепляют в трипсине, чтобы получить одноклеточную суспензию. После подсчета клеток ресуспендировать в объеме матрицы, необходимом для концентрации клеток 1,0 x 106 клеток/мл. Купола тарелок в тарелку используют капельным методом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.