Функционализированное нацеливание на наночастицы рака яичников: метод содействия поглощению наночастиц контрастного вещества с конъюгированной фолиевой кислотой клетками рака яичников

Аннотация

Источник: Lusk, J. F. et al. Обнаружение рака яичников с помощью фотоакустической проточной цитометрии. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем метод, облегчающий интернализацию наночастиц сульфида меди с фолиевой кислотой (CuS NPs). Функционализированные фолиевой кислотой CuS NP обладают способностью нацеливаться на рецепторы фолиевой кислоты, которые сверхэкспрессируются во многих клетках рака яичников.

Протокол

1. Синтез и функционализация наночастиц

ВНИМАНИЕ: Весь синтез должен происходить в вентилируемом химическом вытяжном шкафу.

1. Перед синтезом отфильтруйте около 300 мл деионизированной (DI) воды через стерильный фильтр 0,2 мкм.
2. Очистите стеклянную колбу с круглым дном объемом 250 мл раствором моющего средства и промойте деионизированной водой. Добавьте 0,0134 г CuCl₂ в 100 мл деионизированной воды, чтобы получить раствор с концентрацией 1 мМ.
3. Добавьте 0,015 г фолиевой кислоты (FA) в раствор CuCl₂ и перемешивайте ~5 минут с помощью магнитной мешалки.
4. Добавьте Na₂S·9H₂O (0,024 г в 100 мкл воды DI) в течение приблизительно 10 с в реакционную смесь с помощью пипетки объемом 200 мкл.
   заметка: При добавлении Na₂S·9H₂O раствор изменит цвет со светло-желтого на темно-коричневый.
5. Завершите реакцию и поставьте на масляную баню, установленную на 90 °C, и продолжайте помешивать с помощью магнитной мешалки. Примерно через 15 мин или когда масляная ванна достигнет 85−90 °C, дайте реакции протекать еще час. Ваша смесь должна постепенно приобрести темно-зеленый цвет.
   заметка: Обязательно проветривайте систему во время нагрева реакционной смеси, чтобы избежать повышения давления.
6. Снимите реакционный сосуд с масляной баней и кратковременно охладите при комнатной температуре в течение примерно 10-15 минут, прежде чем переложить на ледяную баню.
7. Как только реакционная смесь остынет ниже 20 °C, отрегулируйте pH до 10, используя 1M NaOH, чтобы растворить оставшуюся фолиевую кислоту в растворе.
8. Очистите реакционную смесь FA-CuS с помощью центрифугирующей колонны с массой 30 кДа. Добавьте раствор партиями по 15 мл в колонку и центрифугируйте при давлении 3082 x g в течение 15 минут.
9. После того, как вся реакционная смесь будет концентрирована, рекомбинируйте концентрированные фракции и промывайте 4 раза 15 мл pH 10 NaOH в центрифугирующей колонне с температурой 30 кДа.
10. Для измерения массы возьмите 1/3 раствора (~66 μл) и разделите на три стеклянных флакона. Сушите в вакуумной печи в течение ночи при температуре 40 °C под вакуумом ~27 мм рт.ст.
11. Растворите остальные 2/3 концентрированного раствора в 250 мкл PBS и храните при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
12. Перед использованием FA-CuS NP обрабатывайте их ультразвуком в течение 30 минут в ультразвуковом аппарате для ванны на высокой температуре.

2. Поглощение НЧ FA-CuS клетками рака яичников

1. Перед инкубацией с НЧ FA-CuS клетки SKOV-3 инкубируют в колбе T75 с 8−15 мл среды RPMI-1640, не содержащей фолиевой кислоты, с 10% FBS и 1% пенициллином/стрептомицином в течение не менее 24 ч.
2. Засейте клетки в 0,5 мл полной питательной среды RPMI-1640, не содержащей фолиевой кислоты, с плотностью 0,1 x 10⁶ клеток/мл в 24-луночный планшет.
3. На следующий день инкубируйте клетки с 400 мкг/мл FA-CuS NPS в 0,5 мл полной питательной среды RPMI-1640, не содержащей фолиевой кислоты, в течение 2 ч.
4. После этой инкубации трипсинизируйте клетки 0,5 мл 0,25% трипсина с помощью ЭДТА. Добавьте не менее 1 мл полной питательной среды RPMI-1640, не содержащей фолиевой кислоты, чтобы нейтрализовать трипсин, и центрифугируйте клетки при 123 x g в течение 6 минут.
5. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 2 мл PBS и центрифугируйте при 123 x g в течение 6 мин. Выполните этот этап промывки 2 раза, чтобы удалить все несвязанные NP.
6. Ресуспендируйте клетки в 1−2 мл PBS с 2% раствором Tween.
7. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и Трипана Блю. Кроме того, разбавьте клетки, если количество клеток слишком велико. Разбавьте клетки в PBS 2% Tween до выбранной концентрации для обнаружения.
8. Теперь клетки готовы к анализу с помощью системы PAFC.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,025% трипсин с ЭДТА	Корнинг	25-053-Кл
Центробежные фильтры Amicon Ultra-15	Многородность	UFC903024
Центробежные фильтры Amicon Ultra-4	Многородность	UFC803024
Гематоцитометр Bright-Line	Хауссер Сайентиал	1492
Хлорид меди(II)	АКРОС ОРГАНИК	206532500
Цифровая ультразвуковая очищающая ванна серии CPX	Фишербранд	Модель CPX3800
Шприцы Norm-Ject 10 мл	ХЕНКЕ САСС ВОЛЬФ	4100-С00В0
ФБС	Сигма-Олдрич	Ф2442-500МЛ
Фолиевая кислота	Сигма-Олдрич	Ф7876-10Г
ПБС	Альфа Аэсар	Дж62036
Пенициллин стрептомицин	GIBCO	15140-122
RPMI Midum 1640 (1x) без фолиевой кислоты	Gibco	No 27016-021
Ячейки СКОВ-3	АТКС	ХТБ-77
Гранулы гидроксида натрия	BDH	BDH9292-500Г
Нонагидрат сульфида натрия	Сигма-Олдрич	431648-50Г
Раствор трипана синего 0,4%	Амреско	К940-100МЛ
Стерильный шприцевой фильтр 0,2 мкм	ВВР	28145-477 (Английский)
Алконокс	Сигма-Олдрич	242985-1,8КГ	Моющее средство, используемое для чистки стеклянной посуды.
Подросток 20	Сигма-Олдрич	П7949-100МЛ

г.