$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Подготовка митохондрий из тканей рака яичников человека
Образцы ткани яичников, включая ткани рака яичников (n = 7), были использованы для этого протокола.
- Приготовьте 250 мл истохондриального изоляционного буфера, смешав 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 100 мМ хлорида калия (KCl), 50 мМ Tris-HCl, 1 мМ диамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,1 мМ этиленгликоля бис(2-аминоэтилового эфира)тетрауксусной кислоты (EGTA), 1 мМ ингибитора протеазы фенилметансульфонилфторида (PMSF), 2 мМ ортованадата натрия (V) и 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 7,4.
- Поместите ~1,5 г тканей рака яичников в чистую стеклянную посуду.
- Добавьте 2 мл предварительно охлажденного митохондриального изоляционного буфера, чтобы слегка смыть кровь с поверхности ткани в 3 раза.
- С помощью чистых офтальмологических ножниц полностью измельчите салфетку примерно на 1 мм3 кусочка, а измельченные салфетки переложите в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Добавьте 13,5 мл митохондриального изоляционного буфера, содержащего 0,2 мг/мл нагарсе, а затем используйте электрический гомогенизатор для гомогенизации (используйте шкалу 2, 10 с 6x, интервал 10 с) измельченных тканей (2 мин, 4 °C).
- Добавьте еще 3 мл митохондриального изоляционного буфера в тканевые гомогенаты и хорошо перемешайте их с помощью пипетирования.
- Центрифугируйте подготовленный гомогенат тканей (1 300 x g, 10 мин, 4 °C). Удалите сырую ядерную фракцию (т.е. гранулы) и оставьте надосадочную жидкость.
- Повторно центрифугируйте надосадочную жидкость (10 000 x g, 10 мин, 4 °C). Удалите микросомы (т.е. надосадочную жидкость) и оставьте гранулы.
- Добавьте 2 мл митохондриального изоляционного буфера и хорошо ресуспендируйте гранулу с помощью легкого пипетирования.
- Центрифугируйте суспензию гранул (7 000 x g, 10 мин, 4 °C). Выбросьте надосадочную жидкость и сохраните сырые митохондрии (т.е. гранулы).
- Добавьте 12 мл среды с градиентом плотности 25% (т.е. Nycodenz) для ресуспендирования извлеченных сырых митохондрий.
- Сделайте прерывистый градиент плотности, заполнив пробирку снизу вверх 5 мл 34%, 8 мл 30%, 12 мл 25% (содержащих сырые митохондрии из стадии 1.11), 8 мл 23% и 3 мл среды с 20% градиентом плотности, и центрифугируйте ее (52 000 x g, 90 мин, 4 °C).
- С помощью длинного и тупого шприца соберите очищенные митохондрии на границе раздела между средой с градиентом плотности 25% и 30% в чистую пробирку.
- Добавьте митохондриальный изоляционный буфер в собранные митохондрии, чтобы разбавить его до трехкратного объема. Центрифугируйте (15 000 x g, 20 мин, 4 °C) и выбросьте надосадочную жидкость.
- Добавьте 2 мл изолирующего буфера митохондрий для ресуспендирования гранулы и центрифуги (15 000 x g, 20 мин, 4 °C). Выбросьте надосадочную жидкость и оставьте гранулы.
- Соберите конечную гранулу (т.е. очищенные митохондрии) и храните ее при температуре -20 °C.
заметка: Объедините все очищенные митохондрии из ткани рака яичников в качестве образца митохондрий для количественного протеомного анализа.