Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Создание клеточной линии in vitro VX2
- Соберите опухоль VX2 из четырехглавой мышцы кролика и нароста на боку мыши.
- Разморозьте замороженные опухолевые блоки VX2 (1 см x 1 см), измельчите на культуральной пластине с помощью лезвия скальпеля и процедите через фильтр 70 мкм, последовательно добавляя небольшое количество сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS), чтобы убедиться, что все клетки процежены до конечного объема 1 мл.
- Подсчитать клетки и разбавить 0,9% фосфатным буферным солевым раствором до концентрации 1 х 107/мл и поместить на лед в стерильную пробирку.<бр/>
заметка: Опухолевые блоки были получены от лабораторного сотрудника в результате предыдущего размножения опухолей VX2 в четырехглавых мышцах кроликов.
- Обезболить самку белого новозеландского кролика (вес 2,5-3,5 кг) 2-5% ингаляционным изофлураном, удалить шерсть, лежащую над местом инъекции, и очистить место инъекции раствором повидон-йода. Введите 500 мкл приготовленной клеточной суспензии VX2 (5 x 106 клеток/мл) в четырехглавую мышцу кролика. Наблюдайте за кроликом клинически на предмет роста опухоли, начиная с 10-го дня.
- Усыпляют кроликов после того, как опухоли достигнут 1-1,5 см в диаметре (измеряются наружно штангенциркульями) с помощью одобренного ветеринарами метода. Подтвердите эвтаназию, проверив жизненно важные показатели, включая частоту сердечных сокращений и дыхание. Иссекают опухоль с помощью стерильных инструментов после очистки области раствором бетадина.
- В шкафу биологической безопасности с помощью стерильных инструментов измельчите опухоль на мелкие кусочки (0,2 см) на чашке для культуры тканей диаметром 10 см с помощью лезвия скальпеля. Пропустите фрагменты опухоли через клеточный фильтр размером 70 мкм с использованием 1 мл HBSS, как описано в шаге 1.1.1. Подсчитайте клетки и разбавьте с помощью 0,9% физиологического раствора до получения 7,5 х 105 клеток в 200 мкл.
- Анестезируют самцов мышей NOD SCID гамма (масса 25 г) с использованием 4% изофлурана в дозе 1 л/мин и поддерживают анестезию с помощью 2% изофлурана. После того, как мыши будут обезболены, введите 200 мкл раствора из шага 1.1.5 в подкожную клетчатку бока мыши с помощью иглы 27 калибра.
- Забор и пассирование клеток VX2 in vitro
- Клинически контролируйте рост ксенотрансплантата два раза в неделю до тех пор, пока опухоли не достигнут 1 см в диаметре, с помощью штангенциркуля.
- Усыпляйте мышей, помещая их в камеру сСО2 или выполняя вывих шейки матки после анестезии 4% изофлураном. Иссекайте опухоли в стерильных условиях в шкафу биологической безопасности.
- Измельчите опухоли с помощью скальпеля на кусочки размером 1-2 мм в чашке для культуры тканей диаметром 6 см, содержащей 3 мл 10% пастбищной бычьей сыворотки (FBS) от Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham'ss F12+.
- Оставьте фрагменты опухоли в покое в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение двух дней, пока клетки не начнут расти из частей опухоли. Впоследствии ежедневно проверяйте культивируемые планшеты с помощью световой микроскопии на предмет слияния клеток. По достижении 70% конфлюенции трипсинизируйте клетки, добавив 1 мл 0,05% трипсина в колбу и поместив обратно в инкубатор при температуре 37 °C на 5 минут.
- Нейтрализуйте трипсин 6 мл среды DMEM/Ham's F12 + 10% FBS, соберите клетки и центрифугируйте при 4 °C в течение 5 мин при 300 x g. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 3,5 мл нового материала DMEM/Ham's F12 + 10% FBS. Семена свежего коллагена 6 см I покрывают пластины 1,6 x 10по 6 клеток на пластину для достижения примерно 50% плотности засева клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: 50% плотности ячеек относится к ячейкам, занимающим 50% площади поверхности пластины при прикреплении.
- Раннее пассирование: Повторяйте описанный выше процесс (трипсинизирование, посев) до тех пор, пока клетки не будут пройдены 5 раз, а затем оценивайте чистоту клеточной линии с помощью ПЦР с использованием количественного ПЦР-анализа, чтобы отличить геномную ДНК кролика от геномной ДНК мыши (см. шаг 1.3.1-1.3.4).
заметка: После 8 пассажей клетки могут быть размножены на обычных адгезивных тканевых культуральных планшетах, не покрытых коллагеном.
- Пассаж, трипсинизация и замораживание аликвот клеток в DMEM/HAM F12+30% FBS+10% DMSO в концентрации 2 x 106 на флакон. Храните клетки в жидком азоте до тех пор, пока они не понадобятся для проведения экспериментов.
- Подтверждение VX2-происхождения выживших клеток:
- Создание стандартного лекарства из очищенной геномной ДНК мыши и кролика (Шаг 1.3.2 и Шаг 1.3.3). Используйте праймеры, которые нацелены на видоспецифичные последовательности во второй открытой рамке считывания элемента ретротранспозона LINE-1.
заметка: Последовательности праймеров для CRPV E6: 5's - GATCCTGGACCCAACCAGTG и 5's - CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Были использованы элементы ретротранспозона LINE-1. Последовательности праймеров для кролика LINE-1: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC и 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Последовательности праймеров для мыши LINE-1: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG и 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
- Чтобы создать стандартную кривую для CRPV E6, очистите лизат опухолевых клеток VX2 (шаг 1.1.1) с помощью коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Количественно оцените эту ДНК с помощью коммерческого анализа. Выполните 6 последовательных разведений от 225 пг/мкл до 0,925 пг/мкл в буфере с низким содержанием ЭДТА-ТЕ. Чтобы создать стандартную кривую для геномной ДНК мыши, разбавьте 100 мкг коммерческой геномной ДНК мыши в буфере с низким содержанием ЭДТА-TE в 5 разведениях от 125 пг/л до 0,0125 пг/л.
- Поместите по 4 мкл из каждого разбавленного раствора из образцов из шага 1.3.2 в лунки и запустите образцы в термоциклере для ПЦР. Используйте значения Cq из каждого прогона вместе с количеством ДНК на лунку для расчета стандартной кривой с использованием автоматических пороговых настроек программного обеспечения термоамплификатора.
- Используйте стандартные процедуры количественной ПЦР для выполнения ПЦР с 40 циклами 2-ступенчатого циклирования (98 °C и 60 °C) на термоамплификаторе. Установите пороговые значения и установите дельта-значения Ct на уровне >35, чтобы обеспечить минимальное загрязнение мыши в клеточной линии кролика VX2. Общий объем каждой реакции составлял 10 мкл, состоял из 5 мкл 2x Mastermix, 1 мкл прямых + обратных праймеров с конечной концентрацией праймера в реакции при 250 нМ и 4 мкл образца ДНК><.
заметка: Устанавливаются пороговые значения, а дельта-значения Ct устанавливаются на уровне >35, чтобы обеспечить минимальное загрязнение мыши в клеточной линии VX2 кролика. Рекомендуемый уровень ДНК VX2 для надежного обнаружения методом количественной ПЦР составляет 1-10 пг.
2. Культура клеток VX2 и создание клеточной суспензии
- Флаконы, содержащие клетки VX2 (замороженные на шаге 1.2.7), разморозить на водяной бане при 37 °C в течение 1 минуты и перенести клетки в коническую центрифужную пробирку с 10 мл питательной среды (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина). Центрифугируйте в течение 8 минут при 107 x g, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 9 мл среды.
- Перенесите повторно суспендированные клетки в большую колбу для культур. Инкубируйте клетки без встряхивания при 37 °C. Ежедневно проверяйте клетки на конфлюенцию с помощью световой микроскопии и меняйте питательные среды каждые три дня.
- Создание культивируемой суспензии клеток VX2 для инъекций
- Трипсинизируйте клетки, добавив 3 мл 0,25% трипсина в колбу, как только клетки достигнут 80% конфлюенции. Поместите колбу в инкубатор (37 °C) на 5 минут. Перелейте раствор в коническую центрифужную пробирку и центрифугу в течение 8 мин при 107 x g, а затем удалите надосадочную жидкость.
- Промойте клеточные гранулы 3 раза 9 мл фосфатно-солевого буфера, центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, как указано выше. Подсчитайте клетки и разбавьте 0,9% фосфатным буферным солевым раствором до концентрации 4 х 10 7 клеток/мл и поместите в стерильную коническую центрифужную пробирку на льду.
- Создание in vivo размноженной суспензии клеток VX2 для инъекций
- Замороженные опухолевые блоки VX2 (1 см х 1 см) разморозьте, измельчите на культуральной пластине с помощью лезвия скальпеля и процедите через фильтр 70 мкм, как описано в шаге 1.1.1. Добавляйте небольшое количество HBSS последовательно, чтобы убедиться, что все клетки напряжены до конечного объема 1 мл. Подсчитать клетки и развести с 0,9% фосфатным буферным раствором до концентрации 1 х107/мл и поместить на лед в стерильную пробирку.<бр/>
заметка: Опухолевые блоки были получены от лабораторного сотрудника в результате предыдущего размножения опухолей VX2 в четырехглавых мышцах кроликов.
3. Создание хирургической модели
- Установление хирургической анестезии и предоперационная подготовка
- За 1 ч до планируемой хирургической процедуры провести предварительную медикацию самок белых новозеландских кроликов (2,5-3,5 кг) с помощью инъекций ацепромазина (1 мг/кг в/м) и мелоксикама (0,2 мг/кг SQ). Обезболить самку белого новозеландского кролика (вес 2,5-3,5 кг) 2-5% ингаляционным изофлураном, удалить шерсть над местом инъекции и очистить место инъекции раствором повидон-йода.
- Интубируйте обезболенных кроликов с помощью ларингеальной маски для дыхательных путей (LMA) и закрепите на месте лентой, поддерживая глубокую анестезию, титруя дозу ингаляционного изофлурана в пределах 2-5%. Регулярно контролируйте хирургическую анестезию на протяжении всей процедуры, проверяя жизненно важные показатели (частота дыхания, наполнение капилляров, сатурация кислорода, если таковая имеется) и отслеживая признаки, указывающие на боль (движение, отказ от раздражителей, шумы) или легкую анестезию (движение, жевание трубки LMA).
заметка: Это должен делать человек, имеющий опыт наблюдения за хирургической анестезией.
- Поместите катетер в ушную вену 22-го калибра в краевую дорсальную вену. Ввести цефазолин (20 мг/кг) внутривенно за 10 мин до хирургического разреза кожи.
- Подстригите шерсть над тазом и животом перед тем, как положить кролика на операционный стол, затем поместите кроликов в дорсальное положение на операционный стол. Очистите операционное поле с помощью 3-ступенчатой хирургической подготовки кожи (бетадиновое мыло, раствор хлоргексидина, раствор бетадина). Накидывайте на операционное поле лапаротомические простыни после того, как разметьте верхнюю часть лобковой кости, оставив открытой область нижней части живота размером 5 см х 5 см.
- Создание лапаротомического разреза и идентификация рогов матки
- Наденьте хирургическую шапочку и маску для лица. Потрите руки хирургическим раствором хлоргексидина или бетадина. Используя стерильную технику, надеть стерильный халат и стерильные хирургические перчатки.
- С помощью скальпеля с лезвием #11 сделайте надрез длиной 2,5 см на 1 см краниально к лобковому симфизу через кожу и подкожную клетчатку живота кролика. Разрежьте прямую фасцию и рассеките прямые мышцы латерально, чтобы обнажить нижележащую брюшину. Резко войдите в брюшину, убедившись, что нижняя поверхность свободна от кишечника или других органов брюшной полости.
- Найдите маточные рога, идентифицирующие мочевой пузырь, и проведите пальцем в перчатке вверх, сзади и латерально над верхушкой мочевого пузыря.
заметка: При необходимости полный мочевой пузырь может быть опорожнен с помощью цифрового давления. После обнаружения проведите рога матки через разрез брюшной полости, чтобы они легли на брюшную стенку.
- С помощью плетеного рассасывающегося шва 3-0 выполните однократное наложение швов на каждый маточный рог примерно на 1,5-2,0 см дистальнее шейки матки. Наложите шов прямо медиально к маточным артериям, которые проходят вдоль латеральной поверхности каждого рога. Плотно завяжите швы, чтобы окклюзировать дистальные части рогов матки (Рисунок 1).
- Миометральная инокуляция VX2
- С помощью иглы 27-го калибра введите 0,5 мл ранее приготовленной суспензии клеток VX2 с шага 2.3.2 (для культивируемой модели VX2) или 2,4 (для модели VX2, размножаемой in vivo) в миометрий каждого маточного рога проксимальнее места наложения шва (между местом наложения шва и шейкой матки). Сделайте инъекцию в течение 1 минуты и убедитесь, что клетки не вводятся в подлежащую полость матки. Обезболите животных с помощью ингаляционного изофлурана (2-5%) и наркозного аппарата с контуром Бейна.
- Надавите на место инъекции миометрия в течение 30 с после инъекции, чтобы свести к минимуму утечку клеток. Осмотрите места инъекций и наложения швов на предмет гемостаза и поместите рога матки обратно в брюшную полость.
- Закрытие хирургического разреза
- Глубокое закрытие брюшной стенки: определите верхушку разреза брюшины и захватите брюшину, прямую мышцу и фасцию тканевыми щипцами.
- Для этого закрепите шов на одной вершине разреза, накладывая швы от поверхностного к глубокому с одной стороны разреза и от глубокого к поверхностному с другой. Завяжите узел. С помощью наложенного шва сделать бегущие швы перпендикулярно разрезу через слои брюшной стенки, работая ступенчато вдоль разреза из стороны в сторону. Завяжите шов и разрежьте.
- Поверхностное закрытие брюшной стенки: Определите верхушку разреза кожи и зашите кожу живота с помощью заглубленного подкожного шва 3-0 рассасывающегося полифиламентного шва. Нанесите хирургический клей на закрытый разрез, чтобы противопоставить края кожи.
- Для этого закрепите шов на одной вершине разреза, накладывая глубокие швы на поверхностные с одной стороны разреза и поверхностные на глубокие с другой. Завяжите узел. С помощью наложенных швов сделайте бегущие швы в дермальном слое параллельно разрезу, работая ступенчато вдоль разреза из стороны в сторону. Завяжите шов и разрежьте.
- Послеоперационный уход
- Пробуждение от анестезии: Выключите изофлуран после закрытия разреза и дайте кролику дышать кислородом через маску, следя за признаками пробуждения (например, спонтанными движениями, открытием глаз и жевательными движениями дыхательных путей ларингеальной маски). Экстубируйте кролика, как только эти признаки будут замечены, и обеспечьте его кислородом с помощью маски и теплого одеяла, пока кролики не станут бдительными и не смогут сидеть самостоятельно.
- Послеоперационный мониторинг: Наблюдайте за кроликами два раза в день в течение 4 дней и ежедневно в течение еще 10 дней после операции. Для мониторинга, оценки их общего состояния, потребления пищи и воды, выделения мочи и кала, оценки боли, веса, жизненно важных показателей (частота сердечных сокращений, частота дыхания) и места операции на предмет отека, эритемы, выделений или расхождения.
- Послеоперационный контроль боли: Применять мелоксикам ежедневно (0,2 мг/кг кв/м) в течение 48 ч после операции, а затем по мере необходимости на основе оценки боли. Применять бупренорфин сразу после операции и каждые 12 ч (0,01-0,05 мг/кг кв. км) в течение 24 ч, а затем по мере необходимости на основе оценки боли
- Антибиотики (энрофлоксацин 5 мг/кг в/м) можно вводить ежедневно в течение семи дней после операции для предотвращения раневой инфекции в соответствии с рекомендациями ветеринарного врача. Вводите подкожные жидкости (15 мл SQ) два раза в день по мере необходимости при обезвоживании, а мягкие продукты или другие пищевые добавки предоставляются ежедневно по мере необходимости для снижения веса.
