Моделирование коммуникации рака яичников для визуализационного масс-спектрометрического анализа: метод идентификации низкомолекулярных химических коммуникаторов в метастатическом развитии опухоли яичников

Аннотация

Источник: Zink, K. E. et al. Захват коммуникации малых молекул между тканями и клетками с помощью визуализационной масс-спектрометрии. J. Vis. Exp. (2019)

Этот протокол описывает технику подготовки образцов путем совместного культивирования эксплантов яичников с раковыми клетками фаллопиевых труб. Эти образцы визуализируются с помощью масс-спектроскопии изображения, или IMS, для обнаружения обмена малыми молекулами между клетками и тканями, приводящего к развитию опухоли.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Настройка и инкубация обработанного ITO слайда для кокультур

1. Неделимые сокультуры
   1. Разжижьте агарозу при температуре 70 °C на горячей плите.
   2. Поместите 8-луночный разделитель на предметное стекло, обработанное окислом индия (ITO) (Рисунок 1A). Резиновое дно на разделителе способствует сцеплению со слайдом, но обязательно применяйте постоянное мягкое давление вниз во время агарозного покрытия, чтобы предотвратить утечку или смешивание между лунками.
   3. Соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл, центрифугируйте (5 мин при 800 об/мин) и ресуспендируйте до 50 тыс. клеток на 150 мкл в 1x среде DMEM. Если другая плотность клеток является оптимальной, убедитесь, что на этом этапе суспензия клеток в 2 раза превышает желаемую конечную плотность (например, для конечной концентрации 50 000 клеток в 300 мкл, плотность клеток на этом этапе составляет 50 000 клеток в 150 мкл).
   4. Перед посевом клеток добавьте эксплант яичника в центр лунки (рисунок 1В).
   5. Добавляйте агарозу к каждой клеточной культуре в отдельных 2 мл пробирок непосредственно перед нанесением покрытия. Для каждой лунки смешайте 200 мкл клеточной суспензии и 200 мкл разжиженной агарозы в пробирке объемом 2 мкл. Например, для четырех лунок соедините 800 мкл клеточной суспензии и 800 мкл 2% агарозы. Некоторое количество смеси останется, но внесение немного больше, чем необходимо, позволит избежать образования пузырьков воздуха во время пипетирования.
      1. Добавляйте агарозу к отдельным культурам клеток непосредственно перед нанесением на эту культуру клеток. Агароза остынет менее чем за минуту, поэтому будьте готовы к подаче на тарелку быстро.
   6. Немедленно добавьте по 300 мкл клеточно-агарозной смеси в каждую лунку (рисунок 1C). На рисунке 1C показаны три состояния клеток и одно состояние среды, каждое из которых покрыто яичником и без него.
   7. Инкубируйте предметное стекло при температуре 37 °C и 5% CO₂ в увлажненном инкубаторе.
2. Разделенные культуры
   1. Вырежьте разделители из тонкого гладкого пластика (Рисунок 2A).
      заметка: В этом эксперименте используются стенки стерильного одноразового бассейна для среды, потому что они плоские и тонкие. Разрежьте их ровно настолько, чтобы они плотно вошли в гипотенузу лунки (~13 мм).
   2. Разжижьте агарозу при температуре 70 °C на горячей плите.
   3. Поместите 8-луночный разделитель на верхнюю часть предметного стекла, обработанного ИТО (Рисунок 2B). Резиновое дно на разделителе способствует сцеплению со слайдом, но обязательно применяйте постоянное мягкое давление вниз во время агарозного покрытия, чтобы предотвратить утечку или смешивание между лунками.

2. Сушка предметного стекла и подготовка к MALDI-TOF MS

1. Через четыре дня (или в любой другой предпочтительный момент времени) снимите перегородку камеры с агарозных пробок и затвора (Рисунок 1D). Аккуратно отсоедините боковые стороны агарозы от камеры плоским шпателем и осторожно потяните камеру вверх, стараясь не сдвинуть агарозные пробки. Если они двигаются, осторожно переместите их так, чтобы они не касались друг друга.
2. Поместите предметное стекло в духовку при температуре 37 °C примерно на 4 часа, поворачивая на 90° каждый час><. заметка: Вращение предметного стекла важно для обеспечения равномерного распределения тепла по всему образцу.
3. После высыхания выньте горку из духовки (Рисунок 1E).
4. Нанесите матричный раствор с помощью распылителя (рис. 1F), со следующими параметрами: температура = 30 °C, расход = 0,2 мл/мин, количество проходов = 8, направление = CC, расстояние между форсунками = 40 мм.
   заметка: Вместо матричного распылителя для нанесения жидкой матрицы можно использовать художественный аэрограф. Для распыления можно использовать тот же матричный раствор, но требуется примерно в два раза больше раствора. Зажав предметное стекло так, чтобы оно висело вертикально, распылите на предметное стекло под углом 90° примерно на один фут, пока не станет виден слой матрицы.
5. Добавьте 1 мкл калибра (фосфорный красный для целей <500 Да, пептидную смесь (см. Таблицу материалов) для целей <5 000 Да) для устранения пятен на предметном стекле. Phosphorus Red не требует смешивания с матрицей, но пептидная смесь требует смеси 1:1 с матрицей для помощи ионизации. Подождите, пока калибр высохнет.
6. Нарисуйте крест с помощью перманентного маркера на каждом углу предметного стекла и сделайте оптическое изображение с помощью камеры или сканера с разрешением 1200 точек на дюйм.

Результаты

Рисунок 1: Рабочий процесс пробоподготовки неразделенной кокультуры. (A) Приклейте 8-луночную камеру к проводящей стороне предметного стекла с покрытием ITO. (B) Поместите разрезанные пополам завязи в центр лунок для условий совместного выращивания. (C) Добавьте 300 μL агарозной/клеточной суспензии непосредственно в лунки. Убедитесь в...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Денвилл	С1017-О	Сбор ячеек
Многородность	PEZGS0816	Перепрофилирован из Millipore Millicell Затвор камеры EZ
Сигма-Олдрич	34998-4Л	Растворитель для напыляемой матрицы
Эппендорф	5810 Р	Чтобы собрать ячейки и удалить всплывающий
Брукер Далтоник	8201344	Матрица распыляется на высохшее предметное стекло
Брукер Далтоник	8201346	Матрица распыляется на высохшее предметное стекло
Gibco	11995-065 (Английский)	Среда смешанная с агарозой
Дженеси Сайентиал	22-282	Для агарозных аликвот
Брукер	8237001	Платформа для инкубации сокультур
Сигма-Олдрич	А9414-10Г	Смешивается с материалами для гальванического покрытия
Корнинг	No 4870	Используется для резки пластиковых разделителей для<бр /> Разделенные камеры
Брукер Далтоник	8206195	Калибр для среднего массового диапазона
Сигма-Олдрич	343-242-5Г	Калибр для малого диапазона масс
Симга-Олдрич	Е2758	Пищевая добавка для клеточных культур
Пепротех Инк.	100-15	Пищевая добавка для клеточных культур
Селлгро	30-005-ЧР	Пищевая добавка для клеточных культур
Сигма-Олдрич	11074547001	Пищевая добавка для клеточных культур
Gibco	No 25030-081	Пищевая добавка для клеточных культур
Gibco	15140-122	Пищевая добавка для клеточных культур
Технологии Фишера	А116-50	Добавлено в матричное решение
Технологии HTX		Для нанесения матрицы