$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Синтез ядра нанозвезды золота
ПРИМЕЧАНИЕ: Золотые нанозвезды используются в качестве ядер для обоих разновидностей нанозондов SERRS, используемых в этом эксперименте.
- Приготовьте 800 мл 60 мМ раствора аскорбиновой кислоты (C6, H, 8O6) в деионизированной (DI) воде и 8 мл 20 мл раствора тетрахлорауриновой кислоты (HAuCl4) в деионизированной воде. Охладите до 4 °C.
- Выполните этот этап реакции при температуре 4 °C. Поместите коническую колбу, содержащую 800 мл раствора аскорбиновой кислоты, на магнитную пластину для перемешивания и создайте устойчивый вихрь. Быстро добавьте в вихрь 8 мл раствора тетрахлорауриновой кислоты. В течение нескольких секунд образуются нанозвезды, и раствор приобретет темно-синий цвет. Если цвет в любой момент времени становится розовым или фиолетовым, что указывает на образование наносфер, суспензию следует отбросить и повторить попытку синтеза.
- Налейте суспензию нанозвезды в конические пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 20 минут (4 °C, 3 220 x g). Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя примерно 200 мкл раствора в каждой пробирке. Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу наночастиц на дне пробирки.
заметка: Надосадочная жидкость должна иметь голубой оттенок из-за оставшихся взвешенных нанозвезд .
- С помощью микропипетки перемешивайте раствор, чтобы суспендировать и собирать наночастицы из каждой пробирки. Часть гранулы может быть уплотнена на дне трубки и не будет повторно суспендировать даже при энергичном пипетировании – выбросьте эту часть.
- Перенесите суспензию наночастиц в диализную кассету (MWCO 3,5 кДа) и диализуйте не менее трех дней против 2 л деионизированной воды, ежедневно меняя воду. Хранить нанозвезды в диализе при температуре 4 °C до месяца с подменой воды каждые 3-4 дня.
заметка: Нанозвезды следует хранить в диализе до тех пор, пока они не потребуются для реакции силикализации, как описано в разделе 2.
2. Формирование оболочки из кремнезема
ПРИМЕЧАНИЕ: Синтезированы две разновидности рамановских нанозондов. Процедура синтеза одинакова для обоих, с той лишь разницей, что используется репортерная молекула комбинационного рассеяния света (краситель). В данном эксперименте используются перхлорат IR780 и IR140. Реакцию всегда следует проводить в пластиковых контейнерах. Синтез обладает широкими масштабируемыми возможностями и может быть отрегулирован в соответствии с желаемым требуемым количеством инжектируемого газа. Здесь описывается синтез средней партии, который может быть линейно масштабирован до меньших или больших объемов по мере необходимости, с теми же концентрациями и временем реакции. Реакции для двух типов нанозондов SERRS могут выполняться параллельно. Обратите внимание, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Ультразвук следует проводить для редиспергирования гранул наночастиц после центрифугирования на этапах промывки или после того, как наночастицы хранились дольше одного часа. Ультразвуковую обработку следует проводить до тех пор, пока наночастицы не станут четко взвешенными в растворе, обычно в течение 1 с.
- В пробирке А (коническая трубка объемом 50 мл) смешайте 10 мл изопропанола, 500 мкл TEOS, 200 мкл деионизированной воды и 60 мкл красителя (перхлорат IR780 или IR140, 20 мМ в ДМФА (диметилформамид)).
- В пробирке B (коническая пробирка объемом 15 мл) смешайте 3 мл этанола и 200 мкл гидроксида аммония. Ультразвуковой обработкой нанозвезд из Шага 1.4 для диспергирования любых кластеров в растворе и добавлением 1,2 мл нанозвезд в пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: раствор гидроксида аммония очень летуч и его трудно точно пипетировать. Храните его при температуре 4 °C до тех пор, пока не понадобится, чтобы облегчить пипетирование.
- Поместите трубку А на вихревой смеситель и создайте устойчивый вихрь. Быстро добавьте содержимое пробирки B в вихрь и продолжайте перемешивать около 5 секунд. Немедленно переложите в шейкер и дайте ему вступить в реакцию в течение 15 минут, встряхивая со скоростью 300 об/мин при комнатной температуре.
- После 15-минутной инкубации погасите реакцию, добавив этанол для заполнения пробирки объемом 50 мл. Центрифуга в течение 20 минут при 3 220 x g и 4 °C.
- Отсадите надосадочную жидкость, оставив около 0,5 мл раствора, стараясь не потревожить гранулу. Добавьте 1 мл этанола и перемешайте с помощью пипетки, чтобы повторно суспендировать наночастицы. Переложите в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и 4 раза промойте этанолом путем центрифугирования при 11 000 x g в течение 4 минут, отсасывая надосадочную жидкость и повторно суспендируя гранулу ультразвуком в течение примерно 1 с.
- Примечание: На этой стадии силикатные наночастицы могут быть функционализированы, как описано в разделе 3, или ресуспендированы в деионизированной воде с дополнительной стадией промывки для хранения при температуре 4 °C в течение недели.
3. Функционализация поверхности
ПРИМЕЧАНИЕ: нанозонды IR780 SERRS будут конъюгированы с антителами, нацеленными на рецептор фолиевой кислоты, с помощью сшивающего агента PEG с образованием αFR-NPs; Контрольные нанозонды IR140 SERRS будут сопряжены с пассивирующим монослоем PEG для nt-NPs. Оба аромата образуются в результате тиол-малеимидной реакции в отдельных, но параллельных реакциях.
- Дважды промойте наночастицы центрифугированием при 11 000 x g в течение 4 минут, отсасывая надосадочную жидкость и повторно суспендируя гранулу в 1 мл этанола с помощью ультразвука. Повторите этап промывки еще раз, но повторно диспергируйте в 1 мл 85% этанола, 10% 3-MPTMS (3-меркаптопропилтриметоксисилана) и 5% воды DI. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1-2 ч для введения тиолов на поверхность частиц.
- Промойте тиол-функционализированные наночастицы центрифугированием при 11 000 x g в течение 4 минут, аспирируя надосадочную жидкость и повторно суспендируя гранулу ультразвуком, дважды в этаноле, два раза в DI и, наконец, в буфере HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновая кислота) (10 мМ, pH 7,1) и отложите в сторону.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать буфер MES (2-(N-морфолино)этанесульфоновая кислота) или HEPES. Буферы с более высокой соленостью, такие как PBS (фосфатно-солевой буфер), могут индуцировать агрегацию наночастиц.
- Для функционализированных αFR-НЧ антитела реагируют 200 мкг антител (клон антитела к антифолат-связывающему белку [LK26]) с десятикратным молярным избытком сшивающего агента ПЭГ (полиэтиленгликоль)(N-гидроксисукцинимид 5-пентаноата) эфира N'-(3-малеимидопропионил) аминоэтана (CAS: 851040-94-3), в диметилсульфоксиде (ДМСО)) в 500 мкл буфера MES (10 мМ, рН 7,1) в течение 30 мин.
- Удалите избыток сшивающего агента и сконцентрируйте антитела путем центрифугирования раствора антитела-ПЭГ в центробежном фильтре (MWCO 100 кДа). Для центробежных фильтров, используемых в этом исследовании, выполните центрифугирование в течение 10 мин при 14 000 x g и 23 °C. Восстановите конъюгированные антитела в свежей пробирке, инвертируя фильтр и центрифугируя при 1 000 x g в течение 2 мин.
- Пипетку с Этапа 3.2 Наночастицы IR780 поместите в пробирку с антителами и перемешайте с помощью пипетки. Смесь инкубируют не менее 30 минут при комнатной температуре или при 4 °C в течение ночи для образования αFR-NPs.
- Для получения nt-NPs добавляют 1% w/v метокси-концевого (m)PEG5000-малеимида (CAS: 99126-64-4), растворенного в ДМСО, к наночастицам IR140 SERRS на стадии 3.2 и дают вступить в реакцию в 500 мкл буфера MES (10 мМ, pH 7,1) в течение не менее 30 минут при комнатной температуре или при 4 °C в течение ночи.
- Для введения мышам (раздел 4) уменьшите оба аромата нанозонда при 11 000 x g в течение 4 минут, отасуньте надосадочную жидкость для удаления раствора со свободными непрореагировавшими антителами/ПЭГ и повторно диспергируйте каждый аромат в буфере MES (10 мМ, pH 7,1) при концентрации 600 пМ. При ресуспендировании наночастиц сведите к минимуму ненужное воздействие ультразвука, чтобы предотвратить денатурацию антитела.
4. Инъекция нанозондов и визуализация
- Подготовьте нанозонды (αFR-NPs и nt-NPs), как описано в разделах 1-3, и смешайте в соотношении 1:1 для получения конечной концентрации 300 пМ каждого типа в буфере MES (10 мМ, pH 7,1). По желанию готовят стандартные образцы по 30 пМ каждого из ароматизаторов нанозонда в небольших (100 мкл) конических пробирках.
- Введите внутрибрюшинно 1 мл суспензии наночастиц каждой мыши и осторожно помассируйте живот, чтобы распределить наночастицы в брюшной полости. Верните мышь в корпус. Через 25 или более минут усыпьте мышь с помощью удушенияCO2.
- Закрепите мышь на хирургической платформе в положении лежа на спине (для визуализации всей брюшной полости платформа должна быть установлена на вертикальном предметном столике микроскопа).
- С помощью зубчатых щипцов и ножниц для рассечения удалите кожу, чтобы обнажить брюшину, и выполните большой сагиттальный разрез (от 2 до 3 см в длину), чтобы обнажить всю брюшную полость. Прикрепите брюшинные створки к платформе. Промойте внутреннюю часть брюшной полости не менее чем 60 мл PBS с помощью пластикового флакона-распылителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить беспрепятственную визуализацию всей брюшной полости, кишечник необходимо мобилизовать или иссечь. Для иссечения проводят резекцию с перевязкой брыжеечных сосудов с целью уменьшения кровоизлияния в брюшную полость.
- В качестве альтернативы, чтобы получить изображение определенных органов, иссеките их после промывки PBS и поместите на предметное стекло микроскопа.
- Перенесите платформу или предметное стекло на рамановский микроспектрофотометр с вертикальной оптической конфигурацией и моторизованным столиком для визуализации; используйте коммерческую систему с диодным лазером мощностью 300 мВт и длиной волны 785 нм, с решеткой 1200 пазов на мм, с центром на 1115 см-1.
- Сфокусируйтесь на интересующей области с помощью оптики белого света, парфокальной с помощью рамановского лазера. Выберите область для съемки и желаемое разрешение; В данном отчете был использован высокоскоростной режим сбора данных (спектры получены при непрерывном лазерном освещении при постоянном движении предметного столика микроскопа, с эффективным пространственным разрешением 14,2 мкм на 200 мкм; при 5-кратном увеличении, мощности 100 мВт на объективе и <экспозиция 100 мс на точку).
заметка: Пробирки с эталонными нанозондами из Шага 4.1 при желании могут быть размещены в области изображения, чтобы обеспечить внутренние эталоны для последующего анализа. Убедитесь, что до объектива не попадают посторонние источники света, кроме лазера.
- По желанию подготовьте образец к гистологической обработке и валидации путем фиксации в 4% параформальдегиде в PBS в течение ночи при 4 °C. Промойте PBS при 4 °C в течение 15 мин не менее двух раз. Держите образец в 70% этаноле в воде до стандартной гистологической обработки и заделки парафина. Для гистологической валидации опухолей срезы (толщиной 5 мкм) с разной глубины парафинового блока могут быть окрашены гематоксилином и эозином (H&E).