Проксимальная культуральная система: метод культивирования in vitro для изучения паракринной передачи сигналов между клетками

Аннотация

Источник: Dasari, S. et al. метод проксимального культивирования для изучения паракринной передачи сигналов между клетками.J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы разрабатываем проксимальную ко-культуральную модель клеток рака яичников и первичных мезотелиальных клеток человека. Эта физиологически значимая модель позволяет изучать паракринную сигнализацию, при которой локализованные концентрации секретируемых факторов сохраняются, предотвращая прямой клеточный контакт.

Протокол

A. Подготовка клеток

1. Выделение и культивирование первичных мезотелиальных клеток человека
   1. Выделите первичные мезотелиальные клетки человека (ГПМЦ) из сальника человека и вырастите их в полной питательной среде [Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM), содержащая 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина, 1% заменимых аминокислот и 1% витаминов] при 37 °C и 5% CO₂,
      заметка: ГПМЦ обычно выращивают до 100% слияния (Рисунок 1A).
2. Условия роста клеток рака яичников
   1. Выращивание клеток рака яичников HeyA8 в полной питательной среде при температуре 37 °C и 5% CO₂,
      заметка: Используйте клетки HeyA8, выращенные примерно до 80% конфлюенции (рис. 1B).

B. Клеточная культура

1. Проксимальный посев посева
   1. Используйте вкладыши Transwell для 6-луночных планшетов с обработанной тканевой культурой поликарбонатной мембраной толщиной 10 мкм с порами 0,4 мкм (10⁸ пор/^см2) и площадью роста 4,67^см2. При необходимости оптимизируйте пластины разных размеров, масштабируя количество засеиваемых ячеек в соответствии с площадью поверхности роста. Перед применением нагрейте полную питательную среду, трипсин и фосфатно-солевой буфер (PBS) до 37 °C.
2. Подготовка вкладышей
   1. Чтобы засеять клетки HeyA8 на нижней поверхности мембраны вкладыша, извлеките вкладыш из упаковки с помощью стерильных щипцов и поместите его перевернутым в стерильную чашку для культивирования диаметром 15 см.
   2. Используйте посуду длиной 15 см, так как она имеет глубину, достаточную для размещения перевернутой вставки, или замените ее любой подходящей стерильной емкостью. В зависимости от эксперимента поместите необходимое количество вкладышей в 15-сантиметровую посуду.
   3. Обозначьте три контрольных элемента и три экспериментальных условия соответственно маркером на краю вставок.
3. Подготовка раковых клеток
   1. Для трипсинизации клеток HeyA8, выращенных при 80% конфлюенции в колбе размером 25 см 2 (~2 x 10⁶ клеток), добавьте 1 мл трипсина (0,25%) в течение 40–60 с и нейтрализуйте трипсин 6 мл полной питательной среды.
   2. Центрифугируйте клетки при 500 x g при комнатной температуре (RT) в течение 3 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл полной питательной среды. Подсчитайте живые клетки с помощью метода исключения трипанового синего красителя.
4. Посев раковых клеток
   1. Суспендируйте 100 000 клеток/мл живых клеток HeyA8 в полной питательной среде. Осторожно посейте 80 000 клеток HeyA8, взвешенных в 800 мкл полной питательной среды на дно вставки (которая теперь обращена вверх, так как она перевернута).
   2. Засейте ячейки так, чтобы они образовали куполообразную форму, чтобы они оставались на вставке (Рисунок 1C). Начните от центра мембраны и двигайтесь наружу концентрическими кругами, медленно пипетируя. Не отходите от края более чем на 3 мм, чтобы предотвратить разлив среды.
      заметка: Количество засеянных клеток будет зависеть от скорости роста клеток и продолжительности эксперимента. Количество клеток HeyA8, засеянных для этой проксимальной культуры, было оптимизировано, и к концу третьего дня клетки будут сливаться на 80–90%.
5. Прикрепление раковых клеток
   1. Накройте миску диаметром 15 см и осторожно переместите чашку с вкладышами в инкубатор CO₂. Критично не нарушить падение среды и ячеек на вкладыше на этом этапе. Оставьте клетки при температуре 37 °C на 4 часа, чтобы раковые клетки могли прикрепиться к вкладышу.
6. Подготовка мезотелиальных клеток
   1. Примерно через 4 ч трипсинизируйте ГПМЦ, выращенные при 100% слиянии в колбе 75 см² (~4 x 10⁶ клеток) 2 мл трипсина (0,25%) в течение 1–2 мин и нейтрализуйте трипсин 12 мл полной питательной среды.
   2. Центрифугируйте клетки при 500 x g при RT в течение 3 минут, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл полной питательной среды и подсчитайте живые клетки с помощью метода исключения трипанового синего красителя.
7. Посев мезотелиальных клеток
   1. Суспендирование 300 000 клеток/мл живых ГПМЦ в полной питательной среде. Добавьте 2,5 мл свежей полной питательной среды в каждую лунку 6-луночного планшета. Осторожно поднесите 15-сантиметровую тарелку со вставками к защитному колпаку. С помощью стерильных щипцов переверните вкладыш и поместите его в лунку 6-луночного планшета так, чтобы он стоял вертикально, при этом клетки HeyA8, прикрепленные к нижней поверхности, погрузили в полную питательную среду (рисунок 1C).
   2. Засейте 450 000 ГПМЦ, взвешенных в 1,5 мл питательной среды внутри вставок с ячейками HeyA8, прикрепленными к поверхности, обращенной к дну лунки (рис. 1В), или во вставки без каких-либо ячеек HeyA8 для контроля ГПМЦ. Добавьте в контрольную систему HeyA8 1,5 мл питательной среды без клеток.
8. Выращивание проксимальной культуры
   1. Дайте проксимальной культуре вырасти в инкубаторе CO₂ при 37 °C и 5% CO₂ в течение 72 ч. При необходимости носитель может быть восполнен следующим образом.
      1. Для внутренней части вкладыша удалите 750 μL и добавьте 750 μL свежей полной питательной среды.
      2. Для внешней стороны вкладыша (6-луночный планшет) удалите 1 мл и добавьте 1 мл свежей полной питательной среды. 1 мл был выбран из-за удобства смены среды за один прием. При желании 1,25 мл можно удалить и заменить на него.

Результаты

Рисунок 1: Сборка проксимальной системы культуры.(A) На этой панели показаны первичные мезотелиальные клетки человека (ГПМЦ). (B) На этой панели показаны клетки рака яичников HeyA8. Масштабные линейки = 200 μм (А-В). (C) Клетки HeyA8 засеивали на нижнюю поверхность трансвелловой вставки с порами 0,4 мкм. После того, как клетки были пр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Проницаемая опора Transwell 24 мм со вставкой из поликарбонатной мембраны 0,4 мкм	Corning (Costar)	No 3412	• Полупрозрачная поликарбонатная мембрана толщиной 10 мкм. • Обработано для оптимального прикрепления клеток. • Упаковано по 6 вкладышей в 6-луночный планшет, по 4 пластины в ящике><. • Мембрана должна быть окрашена для видимости клеток. • Стерилизуется гамма-излучением.
6-луночная пластина	Corning (Сокол)	353046	Плоское дно, обработанное TC, стерильное, с крышкой
Блюдо для культуры 15 см	Corning (Сокол)	353025	Стерильная чашка для клеточных культур, обработанная ТС
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-СВ
Пенициллин стрептомицин	Корнинг	30-002-КИ
Заменимые аминокислоты MEM	Corning (Cellgro)	25-025-КИ
Пипец			Подойдет любая марка
CO2-инкубатор			Подойдет любая марка
Шкаф биобезопасности уровня II			Подойдет любая марка