Моделирование метастазирования рака яичников в слизистой оболочке брюшинной полости: метод создания in vitro 3D-модели слизистой оболочки брюшины

Аннотация

Источник: Peters, P. N. et al. Моделирование ранних стадий распространения рака яичников в органотипической культуре брюшинной полости человека. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы демонстрируем разработку in vitro трехмерной модели слизистой оболочки брюшинной полости. Эта органотипическая культура может помочь в исследовании адгезии, инвазии и пролиферации клеток рака яичников.

Протокол

1. Облицовка органотипической культуры

1. Высвобождайте NOF (нормальные фибробласты сальника) из колбы с культурой размером 75 см² путем полоскания 10 мл PBS с последующим введением 3 мл 0,25% трипсина/25 мМ ЭДТА в течение не более 5 мин. Нейтрализуйте трипсин не менее чем в 3 раза больше объема полной питательной среды.
2. Перенесите трипсинизированные клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и поверните вниз со скоростью 0,5 г x 3 мин. Удалите надосадочную жидкость и верните клетки обратно в 5 мл полной питательной среды. Используйте счетчик клеток для подсчета клеток, извлеченных из колбы с культурой
.
3. Разбавьте клетки в соответствующем объеме полной питательной среды до тарелки 2000-4000 NOF на 100 мкл на черном 96-луночном планшете с ясным дном. Добавьте 0,5 мкг/100 мкл коллагена I крысиного хвоста в клеточную смесь перед нанесением покрытия. Дайте клеткам постоять при температуре 37 °C и 5%_CO2 во влажной среде в течение не менее 4 ч или до тех пор, пока клетки не прилипнут к поверхности пластины.
4. Высвобождают ГПМЦ (первичные мезотелиальные клетки человека) из колбы с культуральными колбами с использованием тех же методов, которые описаны в шагах 1.1 и 1.2. Разбавьте клетки в соответствующем количестве полной питательной среды до 10 000-20 000 HPMC на 50 мкл поверх уже покрытого коллагеном I NOF в 96-луночных планшетах. Дайте клеткам постоять при температуре 37 °C и 5%_CO2 во влажной среде не менее 18 часов перед началом экспериментов.
5. Культивирование клеток рака яичников HeyA8, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), в полноценных питательных средах. Раковые клетки яичников HeyA8 флуоресцентно мечаются экспрессией лентивирусного вектора, экспрессирующего веслоногий рачок cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Раковые клетки яичников HeyA8 должны быть на 80-90% конфлюентными в день использования (логарифмическая фаза роста). Высвобождайте клетки из культивального планшета и подсчитывайте с использованием тех же методов, которые описаны в шагах 1.1-1.2 для первичных клеток.
6. Дайте клеткам рака яичников восстановиться в полной питательной среде в течение 15-20 минут при температуре 37°C в конической трубке с неплотно закрытой крышкой.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ПБС	Научный центр Фишера	SH3001304
Посуда для культуры 15 см	BD Biosciences	353025
DMEM с L-глютамином	Корнинг	10-013-СВ
Витамины MEM	Корнинг	25-020-Кл
Заменимые аминокислоты MEM	Корнинг	25-025-КИ
Пенициллин-стрептомицин	Корнинг	30-002-КИ
шейкер	Термофишер	МаксQ 4450
центрифуга	Эппендорф	5702
инкубатор	Термофишер	Forma Series II Водяная рубашка Инкубатор CO2 модель 3100
Трипсин ЭДТА, 1x (0,25%)	Корнинг	25-053-КИ
Фляги Т-75	BD Biosciences	353136
Фляги Т-175	BD Biosciences	353112
Наконечники для пипеток	Райнин	P2, P10, P20, P200 и P1000
Наконечники для пипеток	Корнинг	Наконечники с фильтром P2, P10, P20, P200 и P1000
Счетчик ячеек	Инвитроген	графиня
Счетная камера для клеток графини Слайды	Инвитроген	С10313
Трипановое синее пятно (0.4%)	Gibco	15250-061
Коллаген I типа (крысиный хвост)	BD Biosciences	354236
Пластина на 96 лунок, прозрачное дно, черная	BD Biosciences	353219